En los análisis biológicos existe un desafío constante de alcanzar suficiente sensibilidad y selectividad en el desarrollo de métodos manteniendo a la vez la robustez y un buen desempeño. Los analitos con un nivel de plasma muy bajo (como los fármacos tópicos, oftálmicos y de inhalación) son particularmente problemáticos. Para lograr un nivel de cuantificación menor a 1 pg/mL se necesita un sistema LC-MS/MS de sensibilidad ultra elevada, pero que mantenga también un alto nivel de selectividad.

La solución tradicional para aumentar la sensibilidad de los instrumentos LC-MS/MS ha sido la de utilizar interfaces más amplias de muestreo. Sin embargo, este abordaje está condicionado por el efecto adverso sobre la robustez del método causada por el gran número de iones neutros y otros contaminantes que entran al sistema.

Una propuesta mucho más elegante consiste en mejorar la eficiencia de la producción, muestreo y transferencia de los iones. En este trabajo se describe una nueva plataforma LC-MS/MS, los sistemas AB SCIEX Triple Quad™ 6500 y QTRAP® 6500, con importantes mejoras en la sensibilidad como resultado de una optimización de la eficiencia de ionización, del muestreo y de la transmisión de iones. Además, un novedoso detector de última generación resulta en una mejora muy significativa en el rango dinámico lineal.

La nueva serie AB SCIEX 6500 ofrece un nivel de sensibilidad jamás alcanzado en un sistema LC-MS/MS. Con la nueva tecnología IonDrive™, se han incorporado innovaciones sustanciales en cada parte del sistema.

Beneficios principales de la tecnología IonDrive™ para análisis biológicos

• La sensibilidad ultra elevada empuja el límite de detección por debajo de 1 pg/mL.
• El rango de masas de 5–2.000 Da ofrece gran versatilidad para la cuantificación de péptidos y moléculas pequeñas.
• El nuevo Detector de Alta Energía IonDrive™ aumenta el rango dinámico.
• La nueva fuente IonDrive™ Turbo V aumenta la eficiencia de ionización y la transferencia de calor.
• El nuevo sistema de direccionado de iones IonDrive™ QJet aumenta la eficiencia de muestreo de iones y la robustez del sistema.

Nuevo sistema de direccionado de iones IonDrive™ QJet

Aumentar la eficiencia de la transferencia de iones hacia la zona de vacío es la clave para ganar mayor sensibilidad sin comprometer la robustez. El nuevo sistema de colimación de iones IonDrive™ QJet representa un diseño revolucionario que aumenta muy significativamente la eficiencia de la transferencia de iones. Consiste en una guía iónica de doble etapa de radiofrecuencias que mejora la captura de los iones desde un orificio más grande, aumentando la eficiencia de transmisión hacia la zona Q0 (Figura 1). Esto se combina con una nueva trayectoria del gas cortina que ofrece una barrera de gas más robusta, así como una mejor separación de los iones con respecto a las partículas contaminantes.

Nueva fuente de iones IonDrive™ Turbo V

La nueva fuente de iones IonDrive™ Turbo V está desarrollada sobre la base de la eficiencia y robustez de la fuente Turbo V original. El nuevo diseño incorpora una disposición optimizada y calentadores de mayor diámetro. Al cubrir una sección transversal más grande del cono de nebulización, se obtienen dos importantes beneficios: por un lado, una mejora en la eficiencia de ionización, especialmente con un caudal mayor y con una fase móvil más acuosa; por otro, un calentamiento óptimo de una zona más amplia. Todo esto acelera y simplifica la optimización de la fuente, y resulta en un método más robusto (Figura 2).

Nuevo Detector de Alta Energía IonDrive™

El nuevo detector de alta energía representa un gran paso hacia adelante en la mejora de la sensibilidad y del rango dinámico. Este detector avanzado ofrece un conteo 20 veces mayor a cualquier otro, lo que implica una mejora en el rango dinámico lineal de hasta 1 orden de magnitud. A su vez, se alcanza una selectividad muy elevada en el límite inferior mediante la tecnología de conteo de pulso. Se trata de un detector que aumenta su rango dinámico sin sacrificar sensibilidad, y viceversa.

Sensibilidad

El límite inferior de cuantificación encontrado para alprazolam en plasma fue de 700 atto gramos (ag) (Figura 3). Se observó una excelente precisión con una desviación estándar relativa de 7,6 % para las inyecciones por triplicado en el límite inferior de cuantificación. Esto representa una mejora de 4-5 veces la relación señal/ruido en comparación con las serie 5500.

También se analizó verapamil tanto plasma, como sin efecto matriz. En el primero se logró un límite de cuantificación de 120 ag en columna con una desviación estándar relativa de 2,7 % (Figura 4). Esto permite llegar a límites de cuantificación más bajos en el rango de 100 fg/mL en plasma. Esto permite hacer realidad el bioanálisis de fármacos tópicos y oftálmicos por debajo de 1 pg/mL.

Experimental

Para evaluar la performance de los sistemas de la serie 6500 en bioanálisis, se prepararon curvas  de calibración de estandares de diferentes analitos comúnmente estudiados en plasma (con proteínas precipitadas) y en soluciones sin matriz. Para todos los experimentos se utilizaron condiciones UHPLC, con un sistema Shimadzu UFLC-XR o Nexera y una columna Phenomenex Kinetix C-18 (50 mm, 2,1 mm D.I., 2.6 ?m). La optimización de caudal de la fuente IonDrive™ Turbo V se realizó mediante infusiones de flujo en T de estándares. También se utilizó un sistema QTRAP® 5500 como referencia. Todas las comparaciones se realizaron bajo las mismas condiciones, haciendo una corrida tras otra de la misma muestra y usando siempre el mismo sistema de UHPLC, la misma columna, fase móvil y muestras.

Rango dinámico

Con la tecnología del detector IonDrive™, el rango dinámico lineal se amplia significativamente sin sacrificar sensibilidad alguna. Es posible alcanzar un rango dinámico lineal de 5,4 órdenes de magnitud, extendiéndolo hasta 500 pg (en columna) con un 95% de exactitud y una desviación estándar relativa de 3,8 % para inyecciones por triplicado (Figura 5). El nuevo detector IonDrive™ logra una tasa muy alta de conteo de pulso, por lo que intensidades de señal del orden de 2e8 cps son posibles sin saturar en nada el detector.

Robustez

La robuztes en días multiples fue evaluada utilizando 1.000 inyecciones consecutivas de Metanfetamina en plasma, para un lote continuo de muestras durante 3 días consecutivos.

La trayectoria optimizada del gas cortina y el sistema de colimación de iones IonDrive™ QJet resultan en un excelente desempeño en la matriz biológica. Fue innecesario utilizar una válvula de desvío de múltiples vías. La desviación estándar relativa para las 1.000 inyecciones fue de sólo el 5,9 % para las áreas cromatograficas sin procesar, y del 3,2 % utilizando relaciones versus estándar interno (Figura 6).

Selectividad

Con estas significativas mejoras en la sensibilidad en el límite de cuantificación, la interferencia de la matriz puede convertirse en un factor limitante. Incluso con la alta selectividad del MRM, la interferencia de picos y una alta línea de base pueden resultar problemáticas.

Para el análisis de salmeterol en plasma, se requiere una ultra sensibilidad y selectividad para lograr límites de cuantificación por debajo de 1 pg/mL. Se encontró que la matriz interfería con el pico del analito, condicionando el límite de cuantificación aun a pesar de alcanzar la sensibilidad necesaria.

Aprovechando la tecnología SelexION™, se utilizó la diferencia en la movilidad iónica para lograr mayor selectividad ortogonal. Esto redujo sustancialmente la línea de base, proveniente de una interferencia isobárica, permitiendo detectar fácilmente 1,4 fg en columna y obtener una relación señal/ruido 10 veces mejor (Figura 7).

Conclusiones

• Los sistemas AB SCIEX Triple Quad™ 6500 y QTRAP® 6500 con tecnología IonDrive™ muestran avances en la sensibilidad sin precedentes, llegando a límites de cuantificación por debajo de 1 pg/mL en bioanálisis.
• La disposición optimizada y los nuevos calentadores de gran diámetro en la fuente IonDrive™ Turbo V aumentan la eficiencia de ionización con grandes caudales y ofrecen condiciones más robustas.
• La mayor eficiencia de muestreo con el sistema de direccionado de iones IonDrive™ QJet aumenta la sensibilidad sin comprometer la robustez.
• Se logran grandes mejoras en la sensibilidad sin renunciar a un aumento del rango dinámico lineal. El nuevo IonDrive™ High Energy Detector aumenta 20 veces la capacidad de conteo de iones, lo que resulta en un rango dinámico lineal de hasta 6 órdenes de magnitud.
• El incremento del rango de masas de 5 – 2.000 Da, ofrece gran versatilidad para la cuantificación de péptidos y moléculas pequeñas.