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Aplicación 

Determinación de alta sensibilidad de micotoxinas: un problema a escala mundial

Las toxinas de origen micótico han puesto en peligro la salud de los hombres desde los comienzos de la agricultura. Ya en la Biblia se encuentran referencias a una enfermedad que puede ocurrir después de la ingesta de cornezuelo de centeno (esclerotos). En la Edad Media, cientos de miles de personas murieron como resultado de un envenenamiento por cornezuelo.

Que una manzana podrida no arruine todo el cajón…

Las micotoxinas se descubrieron en la búsqueda de las causas de ciertas enfermedades que, en principio, no permitían pensar en los detonantes conocidos, como los microorganismos, las toxinas vegetales o los residuos de pesticida. Con el tiempo se estableció que los alimentos infectados con hongos eran responsables de múltiples enfermedades en el ganado. Más adelante, cuando los métodos de investigación analítica alcanzaron un mayor grado de sensibilidad y se pudo analizar un número mayor de alimentos y de sus componentes, se descubrió que los mismos compuestos también podían estar presentes en los alimentos de los hombres y ser causas posibles de enfermedad.

Figura 1:** Fórmula estructural de la micotoxina patulina (C7H6O4, masa mono-isotópica: 154,03), y el equipo Shimadzu LCMS-2010A de cuadrupolo simple.

La contaminación de alimentos para hombres y ganado es un problema de dimensiones globales. La FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación) calcula que hasta un 25% de la producción de alimentos a nivel mundial se encuentra afectada por micotoxinas, y pueden detectarse en alrededor del 20% de la producción de cereales en la Unión Europea. Hasta hoy se tienen muy pocos resultados acerca de sus efectos en pequeñas dosis, especialmente en cuanto al consumo prolongado.

La micotoxina patulina

La patulina se forma por diversas especies de Penicillium, Aspergillus y Byssochlamis. El Penicillium expansum es la principal causa de putrefacción en las manzanas y en muchas otras especies de frutas y vegetales . Sus principales fuentes son, en consecuencia, todos los tipos de fruta, pero especialmente las pomáceas, como las manzanas y las peras, que a menudo se ven afectadas por podredumbre marrón ( Penicillium expansum ).

Las micotoxinas también pueden afectar duraznos, damascos y cerezas . Los cítricos y las ciruelas son menos problemáticos. La patulina puede detectarse en alrededor del 40% de la podredumbre marrón en las manzanas. Las áreas infectadas pueden contener más de 80 mg/kg . Esto significa que un pequeño número de manzanas mohosas puede contaminar un gran volumen de jugo de manzana con una concentración de patulina de 50 ?g/kg o más.

Límites del contenido de patulina según el estándar europeo

La micotoxina patulina ( Figura 1 ) es una lactona insaturada de cinco anillos: 4-Hidroxi-4H-furo(3,2-c) piran-2(6H)-ona (C7H6O4). Desde noviembre de 2003, en la Unión Europea se establecieron los valores máximos permitidos de concentración de patulina en productos que contienen manzana ( Tabla 1 ).

Producto Concentración máxima (µg/kg)
Jugos de fruta (especialmente de manzana), aditivos en otras bebidas, néctares y concentrados, licores, sidra y otras bebidas derivadas de la manzana. 50
Productos sólidos derivados de la manzana destinados al consumo directo, incluyendo compotas y salsas. 25
Jugo y productos sólidos de manzana, incluyendo compotas, puré de manzana y otros suplementos dietarios producidos para el consumo de niños e infantes. 10

Tabla 1: Concentración máxima permitida de patulina.

Detección LC-MS, más rápida y más selectiva

El análisis de patulina en alimentos habitualmente se realiza de acuerdo con el método DIN ISO 8128-1, utilizando HPLC con detector de arreglo de fotodiodos (PDA). Existe, no obstante, una tendencia cada vez mayor a utilizar la técnica HPLC-MS para la identificación y la cuantificación. Para lograr una mayor sensibilidad y selectividad en la determinación de patulina a niveles traza, se desarrolló un método HPLC que utiliza como detección la técnica de espectrometría de masas, como se detalla a continuación. Este método utiliza el LCMS-2010A de cuadrupolo simple de Shimadzu para la detección espectrométrica.

La separación cromatográfica se llevó a cabo sobre una columna de fase reversa de 2 mm de diámetro interno en menos de 15 minutos. La toxina es protonada en el espectrómetro de masas mediante la técnica APCI (“ atmospheric pressure chemical ionisation ”) (detectada a [M+H+]+ = 155 m/z ). Utilizando este método de análisis, se puede detectar el contenido de patulina sin inconvenientes, incluso en concentraciones menores a las partes por billón. A continuación se muestra un cromatograma en modo SIM (“ single ion monitoring ”) ( m/z = 155 ) y una calibración de 5 a 1000 ppb con excelente linealidad (Figuras 2 y 3, Tabla2 ).

Figura 3:** Calibración de 5 a 1000 ppb.

Concentración (ppb) 1 2 3 Promedio (1-3) RSD %
5 1293 1266 1216 1258 3,10
10 2773 2815 3027 2872 4,74
25 6560 6271 7081 5402 7,60
50 14006 14425 14441 14291 1,73
100 28602 29175 28655 28811 1,10
250 69991 75810 74773 73525 4,22
500 165437 161378 156406 161074 2,81
1000 291363 280538 278373 283425 2,46

Tabla 2: Calibración de 5 a 1000 ppb.

Al utilizar la técnica LC-MS, no sólo la patulina puede detectarse con una excelente selectividad, sino que existen otros métodos LC-MS de rutina altamente sensibles para detectar micotoxinas tales como las aflatoxinas, las ocratoxinas y las relacionadas con el ácido fusárico ( deoxinivalenol, etc. ). Debido a la alta selectividad de la detección MS, también es posible realizar una determinación simultánea de varias toxinas en un solo análisis.

El uso de métodos de detección tan altamente sensibles permite monitorear con gran exactitud los niveles de concentración de micotoxinas presentes en los alimentos. Finalmente, constituye una base sólida para el desarrollo de futuras investigaciones sobre los peligros de la contaminación de los alimentos con micotoxinas.

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