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Aplicación 

Identificación de proteínas en un sistema LC-Maldi

El método de Huella Digital de Masa de Péptidos (PMF) sirve para llevar a cabo el proceso de identificación de proteínas en forma rápida y poderosa. Esta nota de aplicación presenta la identificación por búsqueda de ion MS/MS utilizando un LC-MALDI combinado con un sistema nano-LC.

La proteína desconocida es digerida enzimáticamente en pequeños péptidos cuyas masas pueden ser medidas con precisión mediante un espectrómetro de masa. Las masas se comparan in silico con una base de datos conteniendo cadenas proteínicas conocidas (incluso genomas).
Las proteínas pueden identificarse fácil y rápidamente mediante espectrometría de masas. En consecuencia, el PMF es un método ampliamente utilizado por investigadores proteómicos.
Sin embargo, no hay demasiados fragmentos de la digestión enzimática de proteínas de bajo peso molecular, lo que dificulta la identificación de estas proteínas por PMF. Y la escasa abundancia de las proteínas resulta en limitados números de fragmento, lo que las hace imposibles de identificar por PMF. Además, las proteínas modificadas de forma postraslacional generalmente resultan identificadas como proteínas nativas no modificadas; en tales casos, intentaremos la búsqueda de iones como la siguiente opción.

Ubicando los péptidos separados mediante nano-LC y purificados en cada una de las posiciones del plato, la supresión de iones en el MALDI se reduce y la búsqueda de iones péptido MS/MS se realiza automáticamente y con alta sensibilidad. Se combina el uso del plato ?Focus MALDI que concentra las muestras y provee de la más alta sensibilidad, con un identificador de proteínas difíciles de identificar por PFM de alta eficacia.

La muestra se preparó con 300?g de proteína de celulas HeLa, y luego se la separó mediante electroforesis bidimensional. Luego de teñir con rubí SYPRO, se extrajeron algunos spots y se condujo un PMF. Las muestras no pudieron ser identificadas. Entonces se buscaron iones MS/MS utilizando el sistema LC-MALDI, y se identificaron 4 muestras.

Digestión enzimática

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SpotNombre de la proteínaMWPlMASCOT Score
PMFLC-MALDI


1
Proteína asociada al receptor Serine/threonine kinase

38.780


4,98


-


348


2
Glyoxalase domain-containing protein 4

35.192


5,40


-


78


3
Isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha precursor

40.048


6,47


-


162


4
Beta-galactoside-binding lecting precursor

15.058


5,34


-


103

PMF es una técnica efectiva para la identificación rápida de proteínas, pero limitada cuando las cantidades de proteínas son muy pequeñas, cuando los pesos moleculares son bajos, y cuando hay modificaciones de traslación. Este sistema LC-MALDI para llevar a cabo búsquedas de iones MS/MS vía análisis automáticos permite identificaciones altamente confiables, aún en proteínas difíciles de identificar.

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Condiciones analíticas

Electroforesis

1º IEF: Inmobiline DryStrip pH 4-7, 18 cm de longitud.
Voltaje constante: 500V – 3500V, 9 escalas, 18 horas.
2º SDS-PAGE: Concentración de gel: 12,5%. Tamaño: 18cm x 18cm. Corriente constante, 30 mA, 4 horas.
Tinte: Gel de rubí para proteínas SYPRO® ex280, 450nm/Em 610nm (invitrogen)
Detección: FluoroPhoreStar3000® (Anatech Corp) Ex 470 nm/Em 580 nm

HPLC

Columna: MonoCap para flujo rápido (0.1 mmLD. X 150mm)
Fase móvil: A, 0,1% ácido Trifluoro-acetic, 5% acetonitrilo, B; 0,l% ácido Trifluoro-acetico, 90% acetonitrilo. 0%B (0 min) —> 45%B (30 min)
Frecuencia de flujo: 1?L/min
Temperatura de la columna: Ambiente
Volumen de inyección: 90?L
Detección: 220nm
Columna de trampa: L-Column Micro (0.3mmI.D. x 5mm ODS, 5 ?m

AccuSpot

Matriz: 0,5mg/mL –Cyano-4-Hydroxyxinnamic Acid (CHCA)
Matriz solvente: Acetona:Etanol =1:2
Frecuencia de flujo: 1?L/min
Intervalo de spot: 18 segundos.

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