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Nota 

Ultra Fast LC: alta performance, no alta presión (Primera Parte)

En los últimos años ha crecido notablemente la demanda por una mayor eficiencia en el negocio analítico, lo cual ha acentuado, en el campo de las técnicas separativas de análisis (i.e. cromatografías), el importante desafío técnico que significa proporcionar una separación adecuada en corto tiempo.

Una estrategia simple es incrementar el caudal de la fase móvil (o, estrictamente hablando, su velocidad lineal). Sin embargo, seguir esta estrategia utilizando la tradicional columna empacada con partículas de 5 µm de diámetro, conlleva una disminución de la eficiencia, empeorando la resolución analítica.

Para mejorar la resolución en un menor tiempo de análisis, hay múltiples enfoques posibles, pero los dos siguientes parecen ser los más prometedores:

  • Uso de material de relleno de menor diámetro externo
  • Separación a temperatura elevada

Estas estrategias tienen como objetivo incrementar la eficiencia de la columna, ya que ésta es generalmente el componente que limita la eficiencia del sistema cromatográfico como un todo. Particularmente se busca incrementar la performance de la columna, teniendo en cuenta los procesos que ocurren en ella, en una región de alta velocidad de flujo para lograr una buena separación en corto tiempo. Toda optimización requiere un parámetro y, particularmente para la eficiencia, el más utilizado es la Altura Equivalente al Plato Teórico (HETP). La eficiencia es inversamente proporcional al HETP; es decir, al disminuir el HEPT, la eficiencia se incrementa. Hay varios factores a considerar en estas dos estrategias, los cuales se discutirán a continuación.

Eficiencia Cromatográfica

La eficiencia se puede definir como la capacidad de un sistema separativo de eluir los analitos con mínima dispersión.

Una característica de las columnas es que, partiendo de un caudal bajo, la eficiencia se incrementa hasta un determinado valor de caudal de la fase móvil, pero a un caudal mayor o menor que éste, la eficiencia disminuye (el HETP aumenta). Esta relación es típicamente expresada usando la ecuación de Van Deemter , que puede enunciarse de la siguiente manera:

HETP = A dP + B/ū + C dP2 ū

  • HETP: largo de columna requerido para obtener un plato teórico (cuanto menor es este valor, mayor es la eficiencia)
  • dP: diámetro de las partículas usadas en el empaque
  • ū : velocidad lineal de la fase móvil
  • A: difusión por micro corrientes localizadas y de múltiples caminos
  • B: difusión axial
  • C: coeficiente de resistencia a la transferencia de masa.

Como puede observarse, el diámetro de las partículas utilizadas en el empaque tiene una fuerte incidencia en el HEPT. Aún más interesante, como se verá a continuación, es que al disminuir el dP la pérdida de eficiencia al incrementar la velocidad de flujo no es tan marcada. La temperatura afecta en el rango de altas velocidades de flujo, principalmente, los términos A y C, como se verá más adelante.

Estrategia 1: Uso de material de empaque de menor tamaño

Una forma de obtener una separación más rápida es a través del uso de material de empaque compuesto por partículas de menor tamaño.

Como se muestra en la Figura 1 , si se aplica esta estrategia, el HETP sigue siendo inferior al que se alcanza en columnas convencionales, incluso a mayor velocidad lineal de fase móvil. Es más: el incremento de la velocidad lineal no afecta considerablemente al HETP en un amplio intervalo de velocidades.

Curvas de Van Deemter

Figura 1: Curvas de Van Deemter experimental para material de empaque de diferentes tamaños de partícula.

Los gráficos indican que el material de relleno compuesto por partículas de menor tamaño hace posible alcanzar una alta eficiencia de columna a una elevada velocidad de flujo, haciendo posible una buena y rápida separación. Actualmente existe en el mercado un gran número de columnas empacadas con material de 2 µm para lograr una separación más rápida.

Sin embargo, este enfoque es problemático, porque el hardware del cromatógrafo va a estar sujeto a un stress mayor, debido al aumento de la contra presión ejercida por la columna (que es inversamente proporcional al cuadrado del diámetro de la partícula). Este efecto indeseado limita el largo de la columna que se puede utilizar, poniendo un techo a la eficiencia que se puede llegar a alcanzar. Esto se debe a que, para un valor dado de HETP, cuanto más larga es la columna, mayor es el número de platos teóricos del sistema, y esto normalmente repercute en una mayor eficiencia.

La Figura 2 muestra la relación entre la velocidad de flujo y la presión de columna con materiales de empaque de diferentes tamaños.

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Figura 2: Relación entre la velocidad lineal y la presión de la columna.

La contrapresión se incrementa drásticamente a medida que el tamaño de las partículas disminuye. Esto dificulta el uso de columnas de partículas más pequeñas a altos caudales de fase móvil y limita la utilización de columnas largas. Para contrarrestar esta desventaja, existen actualmente en el mercado instrumentos especializados con mejor resistencia a la presión, para lograr una separación de alta velocidad. Sin embargo, estos instrumentos especializados tienen todavía ciertas limitaciones en cuanto a la tolerancia de la presión y sacrifican la precisión de la inyección y la sensibilidad de la detección, limitando su uso en el análisis normal y rutinario. La pregunta que surge es: ¿realmente es necesario, o siquiera beneficioso, usar material de empaque de menos de 2 µm para incrementar la velocidad, teniendo en cuenta que la contrapresión se incrementa tanto?

Shimadzu ha estado invirtiendo tiempo y esfuerzo en resolver esta cuestión, y ahora propone la solución que permite que sus usuarios puedan emplear alta velocidad y alcanzar alta resolución simultáneamente con un instrumento único. La solución propuesta se basa en el uso de una columna empacada con material de relleno uniforme formado por partículas de 2.2 µm. Las figuras 3A y 3B muestran el efecto del diámetro de partículas en los dos parámetros que deseamos comparar: eficiencia y contrapresión, respectivamente.

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Figura 3A: Efecto del diámetro de partícula en la eficiencia

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Figura 3B Efecto del diámetro de partícula en la contrapresión del sistema

uflc-figura-3cFigura 3C Relación porcentual del beneficio (eficiencia) y la desventaja (contrapresión) en función del diámetro de las partículas

LaFigura 3C integra el efecto de dP en estos dos parámetros para la velocidad de flujo marcada en las figuras 3A y B. La presión de columna (línea roja) aumenta drásticamente a medida que el tamaño de las partículas disminuye, mientras que la mejora en el desempeño (línea azul) es muy limitada al utilizar partículas de menor tamaño. Dicho de otra forma, el desempeño con una columna de 2.2 µm no es muy diferente del de una de 1.8 µm , pero la contrapresión es inferior a 2/3 .

Con la nueva columna Shimadzu Shim-Pack XR-ODS , la contrapresión es inferior a la mitad de las columnas de 1.8 µm disponibles comercialmente. Esto significa que ya no es necesario resignar ni el rendimiento ni la facilidad de uso. Ud. puede obtener el mayor rendimiento sin sacrificar la operabilidad.

En las Figuras 3A a 3C se evalúan las condiciones para obtener alta velocidad y alta resolución y, al mismo tiempo, mantener la operabilidad. Como puede observarse, con el uso de partículas de 2.2 µm como soporte sólido, se consigue una alta performance sin un drástico incremento de la contrapresión.

Además, en ciertos casos, las columnas basadas en partículas más pequeñas no son apropiadas para separar pares de compuestos que eluyen muy juntos. Si la resolución es muy crítica, la estrategia natural es usar una columna más larga para mejorar la resolución. Con una columna de menor tamaño de partícula, puede ser imposible usar una columna más larga porque la contrapresión puede exceder la presión operativa permitida. Como resultado, es necesario elegir un flujo menor o una columna más corta para reducir la contrapresión.

La Figura 4 muestra la relación entre el tamaño de partícula y el tiempo requerido para separar dos compuestos críticos con una resolución cromatográfica (Rs) igual a 1,5 . Como se ve en el gráfico, se necesitan 30 minutos para alcanzar dicha resolución en una columna de 25 cm con partículas de 5 µm . Obviamente, una columna conformada por partículas de menor tamaño puede acortar el tiempo requerido hasta que la partícula alcance los 2.2 µm . Sin embargo, debido a la gran presión presente en la columna de menos de 2 µm , el largo de la columna está limitado a una presión fija ( 60 MPa ). En consecuencia, el número de platos teóricos real disminuye y la resolución se empobrece. Por tal motivo, es necesario disminuir la fuerza de elución de la fase móvil para separar completamente los compuestos, lo cual causa un mayor tiempo de retención.

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Figura 4: Tiempo necesario para alcanzar RS = 1.5 para un cierto par de compuestos.

La Figura 5 muestra un ejemplo en el cual la separación crítica fue alcanzada en un tiempo menor con la columna Shimadzu de 2.2 µm que con una columna comercial de 1.8 µm , ya que fue posible usar una columna más larga para obtener un mayor número de plato sin sacrificar el tiempo de análisis. Los compuestos son derivados del D-fenilalanina y del L-fenilalanina .

Es evidente que existe cierta interrelación entre número de platos teóricos, tR y HEPT . Como puede apreciarse en la Tabla 1 , si se quiere conseguir el mayor número de platos teóricos limitados por una presión dada, debe usarse una columna más larga con partículas un poco más grandes (por ej.: 5 µm ). El tiempo requerido para alcanzar la performance es mucho mayor, de manera que existe un balance entre el tiempo y la resolución. Las columnas de 2.2 µm resultan ser óptimas para equilibrar la reducción del tiempo y alcanzar una buena eficiencia.

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Condiciones experimentales: Las fases móviles utilizadas consistieron en una mezcla de buffer (100 mmol/L fosfato de potasio pH 6.8) y acetonitrilo. En cada caso, la relación buffer:acetonitrilo v/v fue: Figura 5 superior = 77:23, Figura 5 inferior = 84:16. La temperatura de la columna fue de 50ºC y la detección UV fue a 350 nm.

Tamaño de partícula (µm) Velocidad lineal óptima (cm/min) HETP Mínimo (µm) Largo de la columna para alcanzar 60MPa (mm) Número de plato teórico alcanzable tR (k´=0) (min)
1.8 31.11 4.16 104 25048 0.33
2.2 25.46 5.08 190 37418 0.75
3.0 18.67 6.93 482 69579 2.6
5.0 11.20 11.55 2232 193275 19.9

Tabla 1: Relación entre tamaño de partículas y números de platos teóricos alcanzables.

La Figura 6 muestra un ejemplo de la reducción de tiempo usando una columna empacada con partículas de 2.2 µm. El tiempo de análisis se redujo 6 veces sin sacrificar la resolución ni incrementar significativamente la presión.

Como se muestra en el gráfico, la selección del tamaño de partícula es de vital importancia para obtener resultados óptimos, mientras que el uso de partículas más pequeñas no necesariamente ofrece mejores resultados. La alta presión es simplemente una consecuencia del hecho de que las partículas sean demasiado pequeñas.

UFLC

Condiciones cromatográficas: Fase móvil = agua : acetonitrilo (30 : 70, v/v); Temperatura = 40º C; detección UV a 245 nm; Analitos: 1 = acetofenona; 2 = propiofenona; 3 = butyrophenona; 4 = balenofenona; 5 = hexafenona; 6 = heptafenona; 7 = octafenona.

En el próximo número continuaremos dando más aplicaciones con Ultra Fast LC:

  • Mejora de resolución y reducción de tiempos a temperaturas elevadas
  • Modo isocrático a temperaturas elevadas
  • Utilización de elusión con gradientes
  • Corridas con gradientes de ciclo ultra rápido
  • Reproducibilidad de los tiempos de retención en corridas extra rápidas y con elusión con gradientes

Estas y otras posibilidades de aprovechamiento que otorga el Prominence, el LC más adecuado para aplicaciones de Ultra Fast LC.

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Segunda parte

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