En este trabajo se utilizó un sistema de exploración de métodos basado en UHPLC, con el que se logró reducir drásticamente el tiempo total del experimento en comparación con los abordajes convencionales. Esta tecnología ofrece la posibilidad de realizar separaciones cromatográficas en diferentes columnas con diferentes fases móviles, permitiendo investigar así exhaustivamente las mejores condiciones analíticas separativas. La sensibilidad, influenciada por el pH de la fase móvil, también se vio optimizada con este abordaje. La exploración de métodos se aplicó a un análisis simultáneo de impurezas genotóxicas, diferentes aminas y compuestos acídicos por UHPLC con un instrumento LC/MS de simple cuadrupolo.

Descripción del sistema Nexera de exploración de métodos

• Puede realizar una exploración basada en un máximo de 6 columnas y 16 fases móviles
• Puede ser utilizado con casi cualquier columna UHPLC
• Permite configurar fácilmente las condiciones de exploración gracias a su software
• Ofrece un control automatizado de todo el análisis desde el chequeo del sistema hasta la exploración y el apagado

Figura 1: Esquema general y características del sistema

Figura 2: Pantalla principal del software Method Scouting Solution

• Fácil operación: Las fases móviles y las columnas se seleccionan en la misma pantalla. La interfaz con el usuario permite una operación sin dificultades.
• Perfecta conexión: el software se conecta con el LabSolutions (Ver. 5.42 ó posterior).
• Esquema de trabajo mejorado: la secuencia de análisis se crea automáticamente.

Análisis con el sistema Nexera de exploración de métodos

Figura 3: Estructuras de los compuestos analizados

Exploración de fases móviles y columnas (paso 1)

El propósito de este paso es encontrar la mejor combinación de fases móviles y columnas usando condiciones típicas de gradiente (Tabla 1). En estos experimentos se utilizaron 12 combinaciones de fases móviles y 6 diferentes columnas (Fig. 1).

Gradiente binario	B conc. 5% (0 min) “ 95% (5-7 min) ” 5% (7,01-12 min)
Caudal	0,3 mL/min
Volumen de inyección	2 µL, 20 mg/L de cada componente
Temperatura de columna	40 ºC
Ionización	ESI (positiva y negativa)
Detección	SIM de aductos para cada compuesto (([M+H]+, [M+NH4]+, [M-H]-, [M+HCOO]-)

Tabla 1: Condiciones analíticas del paso 1.

Evaluación de patrones cromatográficos y de la intensidad de iones (paso 2)

Figura 5: Cromatogramas representativos en las condiciones de fase móvil elegidas usando una columna Kinetex C18 (FA y AF indican ácido fórmico y formiato de amonio respectivamente, por sus siglas en inglés).

Optimización de las condiciones de gradiente (pasos 3 y 4)

Para mejorar la separación y la sensibilidad en el análisis de aminas, se optimizaron las condiciones de gradiente usando el sistema de exploración de métodos.

Figura 6: Optimización de las condiciones de gradiente para la separación de aminas

Método optimizado

Figura 7: Método optimizado para cada grupo

Conclusión

• El software Method Scouting Solution permitió optimizar el método analítico separando los compuestos de diferentes propiedades en una sola secuencia.
• Se pudo elegir el método más apropiado para cada clase de compuestos (también se pudo optar por un método genérico para lograr la separación de todos los compuestos).
• Al optimizar el método se mejoró significativamente la sensibilidad.
• La integración perfecta del software aumentó la velocidad y la eficiencia en el proceso de optimización de métodos.