La cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) es una variante de la cromatografía líquida en fase normal que se superpone parcialmente a otras aplicaciones cromatográficas, como la cromatografía iónica y la cromatografía líquida en fase reversa. Sin embargo, no todos los investigadores saben cuál es el mejor momento de usar la separación por HILIC. Por este motivo, voy a desglosar toda la información y a ayudar a responder la pregunta que todos nos hacemos:
¿Cuándo debo usar el modo la cromatografía de interacción hidrofílica, aka HILIC?
Respuesta: Aunque aparentemente debería ser una respuesta sencilla, el tema de HILIC es un poco más complicado. Aunque soy un defensor de las separaciones por HILIC, soy consciente del gran número de dificultades que impiden que sea ideal en muchas situaciones prácticas.
HILIC puede ser una técnica potente y efectiva para los casos más difíciles, si se logran superar algunos obstáculos comunes y encontrar las situaciones más adecuadas.
Las aplicaciones más comunes en las que se puede usar el modo HILIC es con LC-MS/MS.
Analitos polares: Esto es difícil sobre todo en fase reversa, ya que su retención débil limita el alcance de los parámetros de optimización del método y la selectividad.
Cantidades traza: Por motivos de solubilidad en acetonitrilo, que suele ser un solvente de inyección necesario.
Detección por espectrometría de masas: Otras soluciones más conocidas para los analitos polares no son compatibles con la espectrometría de masas, mientras que las composiciones de elución por HILIC son ideales con la MS.
Estos tres puntos son necesarios para colocar al modo de separación por HILIC entre las principales vías de desarrollo de métodos, encabezando la lista junto con los métodos bioanalíticos y de residuos únicos para pesticidas.
Las soluciones comunes para los analitos polares son el intercambio iónico (por lo general buffers no volátiles incompatibles con la espectrometría de masas), la fase reversa altamente acuosa en fases fenilo o polares funcionalizadas (baja retención y baja desolvatación en una fuente de ionización por electrospray), los agentes de emparejamiento iónico (no compatibles con la espectrometría de masas o problemas de efecto memoria) y las fases móviles con pH básico para neutralizar los analitos básicos débiles (menos columnas son estables a pH básicos y, en teoría, podrían suprimir la sensibilidad en modo de ionización positiva).
Tomando en cuenta que estas soluciones comunes tienen sus propios inconvenientes, uno podría preguntarse por qué no está HILIC entre las soluciones principales para una gama más amplia de aplicaciones de analitos polares, así que aquí describimos algunas de las dificultades técnicas más comunes de este método:
Degradación del solvente relacionada con la inyección. El acetonitrilo o los solventes con alto contenido de acetonitrilo son un requisito habitual en el modo de separación por HILIC, y son mucho más exigentes respecto al solvente de inyección que la fase reversa. Esto incluye un mayor mantenimiento del inyector y controles de la válvula, que parecen exacerbarse en una separación en modo HILIC.
Interacciones iónicas. Estas pueden ser más difíciles de controlar, y dependen del pH, la concentración del buffer y la temperatura. Con frecuencia, HILIC depende de estas interacciones para ser robusta y reproducible. Puede ser necesario realizar pequeños ajustes en la metodología.
Regiones de supresión iónica no tradicionales. Debido a que se usan las interacciones polares para la retención y la selectividad, no todos los componentes con supresión iónica se eluyen en el volumen muerto sin ser retenidos. Esto hace que los resultados salgan con los analitos de interés en el corazón de un gradiente, lo que los hace potencialmente impredecibles si no se caracterizan a través de estudios de infusión detallados, y puede ser la principal preocupación técnica de un modo de separación por HILIC.
Disminución de la capa con alto contenido acuoso. La HILIC puede ser claramente distinta de la fase normal, no sólo por el uso de solventes de fase reversa, sino también desde el punto de vista mecanístico. Aunque se usa relativamente menos acetonitrilo polar como solvente débil (lo que favorece la retención) con un buffer acuoso como solvente fuerte (lo que favorece la elución), aún se necesita una fase móvil acuosa para mantener la fase estacionaria polar saturada de humedad. Esto se hace para facilitar la partición (retención) dentro y fuera de la fase estacionaria a través de la capa con alto contenido acuoso.
Las interacciones iónicas y dipolares en la fase estacionaria siguen siendo importantes para la selectividad, pero se piensa que el mecanismo de retención principal gira en torno a este equilibrio de partición. Conceptualmente, puede ser el motivo por el que el acetonitrilo es el único solvente que funciona como solvente primario débil, ya que es más propenso a facilitar esta partición. Hay que recordar que al mezclar acetonitrilo y agua en la premezcla de la fase móvil, la solución se enfría (endotérmica) y hace falta energía mecánica para que se mezclen, a pesar de ser miscibles. La acetona es el único solvente alternativo en una separación por HILIC real, mientras que otros solventes, como el metanol, rompen la partición (y dependen de las interacciones iónicas para retener con éxito los compuestos polares).
Estas dificultades pueden superarse y me gustaría añadir un pequeño beneficio del modo la cromatografía de interacción hidrofílica para los analitos polares en comparación con la fase reversa, que está relacionado con la matriz de muestra y la fuerza eluotrópica de la fase móvil. En fase reversa, si se van a retener analitos polares con baja fuerza eluotrópica (altamente acuosos), todo lo que haya en la muestra con una polaridad media o no polar se retendrá en la fase estacionaria de la columna. Estos analitos se eluirán de manera impredecible en las siguientes inyecciones, saturarán la columna y limitarán su vida útil, requerirán un gradiente más largo y el reequilibrado para su elución, y/o ocasionarán falta de reproducibilidad.
