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Aplicación 

Detección de péptidos en matrices complejas con el esquema de trabajo MIDAS™

La identificación de proteínas en mezclas complejas se obtiene de los datos de análisis LC-MS/MS de una mezcla de péptidos creada por digestión de proteínas de la proteasa. Lograr una identificación confiable y exhaustiva de proteínas poco abundantes resulta difícil debido a que los esquemas de trabajo que dependen de los datos se guían por la intensidad...

La identificación de proteínas en mezclas complejas se obtiene, por lo general, a través del análisis mediante LC-MS/MS de una mezcla de péptidos generada por la digestión mediante proteasas. Lograr una identificación confiable y exhaustiva de proteínas poco abundantes resulta difícil debido a que los esquemas de trabajo que dependen de los datos obtenidos se guían por la intensidad: primero y preferentemente se seleccionan para el análisis los péptidos de mayor intensidad. Repetir los análisis de la misma muestra compleja a menudo resulta en una detección de los mismos péptidos, y no siempre mejora la identificación de las proteínas menos abundantes. Además de proporcionar la identificación de péptidos, la obtención de un buen espectro MS/MS es útil cuando se desarrollan transiciones de Monitoreo de Reacciones Múltiples (MRM) a péptidos en un ensayo cuantitativo. Comprender la intensidad relativa de los iones-fragmento motiva el diseño MRM y permite realizar un control de calidad de los ensayos. Con frecuencia, un experimento con objetivos más específicos puede arrojar mejores resultados en menos tiempo.

A continuación ponemos a prueba la utilidad del esquema de trabajo MIDAS™ ( M RM I nitiated D etection A nd S equencing, detección y secuenciación iniciadas por monitoreo de reacciones múltiples) en un sistema QTRAP® 4500 para detectar péptidos no observados anteriormente de proteínas objetivo. El MIDAS™ aprovecha el carácter híbrido de la tecnología del QTRAP®, utilizando el barrido MRM por cuadrupolo para detectar los péptidos de interés y la trampa de iones lineal para obtener un barrido MS/MS completo de los péptidos detectados (barrido TripleTrap™, Fig. 1). Para los péptidos no detectados anteriormente, las transiciones MRM se pueden computar in silico a partir de la secuencia de proteínas (Fig. 1).

Figura 1: Detección inicial con MRM y Secuenciación usando el  Esquema de Trabajo MIDAS™. Las transiciones MRM para péptidos de las proteínas buscadas son predichas in silico y usadas como un barrido de búsqueda (survey scan) para la detección de péptidos específicos. Cuando la señal MRM es detectada, un espectro  MS/MS de alta calidad y alta sensibilidad, es adquirido para la confirmación de la secuencia y la identificación del péptido/proteína. Una vez detectado, un ensayo MRM optimizado se puede realizar para cuantificar.

En este trabajo, tres proteínas de E. Coli fueron el evaluadas mediante el esquema de trabajo MIDAS™, para aumentar la confianza en la identificación de proteínas y proporcionar MS/MS para el desarrollo de ensayos de MRM. Este mismo flujo de trabajo también puede ser aplicado a la detección específica de modificaciones post-traduccionales, tales como la fosforilación.

Principales ventajas del sistema QTRAP® 4500 para la detección de péptidos

  • El carácter híbrido (triple cuadrupolo y trampa de iones lineal) del sistema QTRAP® 4500 permite construir potentes esquemas de trabajo, aprovechando el sensible y selectivo modo de búsqueda del cuadrupolo acoplado a la altísima sensibilidad de la trampa de iones lineal MS/MS.
  • El MIDAS™ (Fig. 1) es un ejemplo de esquema de trabajo híbrido que utiliza transiciones MRM como barrido de reconocimiento para detectar los péptidos clave en muestras complejas.
  • El MIDAS™ aumenta la confiabilidad en la identificación de proteínas al detectar nuevos péptidos sin tener que volver a preparar la muestra.

Métodos

Preparación de muestra: Una muestra de la proteína E. coli fue reducida, alquilada y digerida con tripsina para el análisis por LC-MS/MS. Se colocó la mezcla de péptidos resultante (4 µg) en la columna LC para cada análisis MS.

Cromatografía: La mezcla de péptidos fue separada en un sistema Eksigent nanoLC-Ultra® 2D con un sistema cHiPLC®-nanoflex (Eksigent, USA) en el modo de trampa de elusión. En cada inyección, la muestra fue desalada en una trampa de chip de 200 µm x 6 mm y luego eluida en una columna de chip de 200 µm x 150 mm para análisis MS. Tanto la trampa como la columna de chips fueron ChromXP C18-CL 3 µm 120Å phase (Eksigent). Los péptidos fueron separados usando un gradient lineal formado por A (2% ACN, 0.1% FA) y B (98% ACN, 0.1% FA) desde 10–30% de B más de 45 minutos a un flujo de 1 µL/min.

Espectrometría de masas: Para el análisis MS se utilizó un sistema QTRAP® 4500 (AB SCIEX). En este estudio fueron usados dos flujos de trabajo: A) un flujo de trabajo básico IDA para la identificación de proteínas que consiste en un escaneo de reconocimiento con trampa MS (EMS scan, Escaneo Mejorado), seguido de 8 escaneos MS/MS del ion producto y B) el flujo de trabajo para detección de péptidos MIDAS™ estipulado (Fig. 1). La determinación “in silico” de transiciones MRM de tres proteínas objetivo de E. Coli para uso en el método de adquisición de esquema de trabajo MIDAS™ se realizó utilizando el software Skyline.

Procesamiento de datos: Los datos se procesaron utilizando el software ProteinPilot™ 4.1. La identificación de proteínas se realizó contra una base de datos UniProt filtrada por entradas relacionadas con E. Coli .

Extendiendo los resultados de la identificación de proteínas

Se analizó una digestión de E. Coli utilizando un esquema de trabajo convencional para identificación de proteínas en el sistema QTRAP® 4500. Sólo tres proteínas fueron identificadas por un único hallazgo de péptido de alta puntuación. Cada una de esas proteínas fue establecida usando el esquema de trabajo MIDAS™ para obtener información adicional en pos de una identificación más confiable (Fig. 2). Para las tres proteínas seleccionadas se crearon in silico 69 transiciones MRM a partir de los varios péptidos trípticos usando el software Skyline. En el experimento LC-MS/MS se monitorearon estas transiciones que sirvieron como barridos de reconocimiento para comenzar a obtener espectros MS/MS. Se realizó una búsqueda de los datos resultantes con el software ProteinPilot™ para lograr la identificación de péptidos. El espectro de péptidos anotados SAFDEFSTPAAR (Fig. 2) muestra una buena calidad MS/MS, resultando en una identificación altamente confiable.

Figura 2: Screening Específico de la secuencia peptídica SAFDEFSTPAAR proveniente de la Glutaredoxin-2. La tabla superior muestra las transiciones MRM para el péptido, SAFDEFSTPAAR predicho in silico. Eso dispara el barrido MS/MS (abajo) que fue entonces buscado en base de datos e identificado como Glutaredoxin con un 99% de confianza.

La figura 3 muestra los mapas de cobertura de la secuencia peptídica el nucleósido purínico de la proteína fosforilasa para el experimento convencional de identificación ( untargeted , arriba) y para el experimento según el flujo de trabajo MIDAS™ ( targeted , abajo). El texto en verde indica elevada confiabilidad en la identificación de péptidos y destaca las mejoras en la identificación de proteínas usando el método MIDAS.

Figura 3: Resultados de la identificación de proteínas. ProteinPilot™ Software fue usado para la búsqueda en ambos Esquemas de Trabajo, IDA y MIDAS™. Mostrándose la cobertura de la secuencia para Fosforilasa del Nucleósido Purina del experimento de proteínas desconocidas (arriba) y el experimento específico MIDAS™ (abajo). La identificación del péptido con un 95% de confianza se muestra en texto verde, mostrando mayor confianza usando los experimentos específicos. Estos datos pueden ayudar a conseguir mayor confianza en la ID de  las proteínas y ser una guía para diseñar ensayos MRM cuantitativos.

En la Fig. 4 se sintetizan las mejoras en la identificación de las tres proteínas. Todas ellas, que fueron el éxitos aislados en los experimentos IDA iniciales, pudieron ser caracterizados a través de por lo menos cuatro coincidencia peptídicas de alto puntaje siguiendo el el experimento MIDAS™ Workflow. Como consecuencia, el cubrimiento promedio de la secuencia peptídico de cada proteína se incrementó de 2.5 a 6 veces.

Figura 4: Sumario de los resultados de la ID de tres (3) Proteínas Específicas. Los resultados de la identificación inespecífica (azul) y específica (rojo) basados en el nivel de confianza (arriba) o el rango de péptidos de alta probabilidad (abajo). Para cada una de las proteínas inespecíficas, glutaredoxin-2, proteína externa slp (sexo-limitada) y la Fosforilasa del Nucleósido Purina, el  Esquemas de Trabajo MIDAS™ aumenta el numero de péptidos de alta confianza a 4 o mas.

Una vez obtenido el espectro MS/MS de barrido completo de las proteínas de interés, la optimización del ensayo cuantitativo es sencilla (Fig. 5).

Figura 5: Experimento de validación del esquema de trabajo MIDAS™. Cromatogramas de ion extraído con 69 transiciones MRM de las 3 proteínas objeto de análisis, Glutaredoxin 2, proteína externa slp (sexo-limitada) y la Fosforilasa del Nucleósido Purina, en el digesto complejo de E. coli.

Conclusiones

El Monitoreo de Reacciones Múltiples (MRM) es ideal para el seguimiento de péptidos de baja abundancia y modificaciones pos traslacionales en mezclas complejas y su habilidad de disparar eventos de barrido MS/MS permite la confirmación de la especie detectada. Debido a su alta especificidad y sensibilidad, esta investigación dirigida puede ser utilizada para profundizar los estudios de digeridos proteicos complejos, identificando con confianza péptidos de baja abundancia. Este esquema único de trabajo solo puede ser alcanzado con sistemas híbridos triple quadrupolo – trampa lineal de iones, como ser el sistema QTRAP® 4500, donde la sensibilidad, especificidad de la detección MRM puede ser fácilmente combinable con la alta sensibilidad de la confirmación que permite las trampas lineales.

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