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Aplicación 

Screening, Confirmación Definitiva con Librerías de Espectros EPI y Cuantificación de Drogas de Abuso

La Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS/MS), es una herramienta analítica ampliamente utilizada para monitoreo y confirmación de drogas de abuso en muestras forenses. Como la necesidad de monitorear un número siempre creciente de drogas continúa en aumento...

Figura 1: Sistema LC-MS/MS AB Sciex QTRAP® 4500

La Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS/MS), es una herramienta analítica ampliamente utilizada para monitoreo y confirmación de drogas de abuso en muestras forenses. Como la necesidad de monitorear un número siempre creciente de drogas continúa en aumento, también crece la necesidad de detectar y cuantificar diferentes compuestos en un solo análisis. Además, conforme aumenta el número de muestras, también es necesario reducir los tiempos de análisis.

Para enfrentar estos desafíos analíticos, el sistema LC-MS/MS QTRAP® 4500 desarrollado por AB SCIEX incorpora una eficaz tecnología de detección de espectros de masas. La inigualable velocidad dela detección MRMresulta posible gracias a la electrónica avanzada eQ™ y a la celda de colisión Qurved LINAC®, que permiten aprovechar usar sistemas UHPLC sin poner en riesgo la calidad de los datos. Estas características, combinadas con el algoritmo Scheduled MRM™ y una rápida inversión de polaridad, permiten obtener datos de la mejor calidad y cubrir el mayor espectro de drogas posible. Además, se pueden obtener espectros MS/MS en la misma corrida para una identificación de compuestos de máxima confianza basada en la búsqueda en una biblioteca de espectros de masas. Estos avances permiten monitorear grandes paneles de analitos en poco tiempo con elevada confiabilidad en la identificación.

A continuación presentamos un método LC-MS/MS utilizando el algoritmo Scheduled MRM™ combinado con una rápida inversión de polaridad y obtención de espectros MS/MS para identificación de compuestos mediante búsqueda en biblioteca de espectros de masas. El método fue aplicado con éxito en la cuantificación e identificación de drogas presentes en muestras de orina.

Características clave del QTRAP® 4500

La fuente Turbo V™ con interfaz de gas cortina reduce el ruido de fondo químico y permite utilizar caudales de hasta 5 mL/min.

El sistema de direccionado de iones QJet® los captura y concentra dentro de una cámara de alto vacío, utilizando una combinación de introducción de gas nitrógeno, en forma dinámica, y un campo de RF; capturando más iones e incrementando la sensibilidad, frente a diseños de lentes tipo “Skimmers”.

La celda de colisión Qurved LINAC® permite minimizar las pausas transiciones MRM y los tiempos de demora de las transiciones mismas (dwell times) sin pérdida de sensibilidad y con la posibilidad de analizar múltiples compuestos a la vez.

La sensibilidad excepcional del triple cuadrupolo y de la Trampa de Aceleración Lineal (QTRAP®) permiten una identificación, caracterización, confirmación, y cuantificación de analitos poco abundantes con un alto grado de confiabilidad en un solo experimento.

Además, el algoritmo Scheduled MRM™, una herramienta avanzada de software, utiliza en forma inteligente información sobre los tiempos de retención para optimizar automáticamente el los tiempos de demora de cada transición MRM y el tiempo de ciclo de todo el experimento, arrojando resultados de la más alta calidad. Para aumentar todavía más la confiabilidad de los resultados analíticos, la tecnología QTRAP® permite obtener en forma rápida y sensible espectros MS/MS en modo EPI e identificar los compuestos realizando una búsqueda en biblioteca de espectros. La información completa de la huella molecular grabada en los espectros EPI reduce significativamente el riesgo de resultados falso-positivos.

Detalles del método

Se tratan 50 µl de orina fortificada con 20 µl de estándar interno y solución de B-Glucuronidasa hidrolisada. La dilución total de la muestra fue de 4.4 veces.

El sistema HPLC consiste en un Shimadzu UFLCXr con una columna Phenomenex Kinetex 2.6 C18, 100 Å y 500 x 3.00 mm

Para demostrar la tecnología del sistema QTRAP® 4500 se desarrollaron los siguientes tres experimentos.

Experimento 1:

  • Un gradiente de 15 min de buffer acuoso de formiato de amonio y metanol, con un flujo de 0.4 ml/min
  • Se fijó el volumen de inyección en 10 µL.

  • Se utilizó el sistema AB SCIEX QTRAP® 4500 con la fuente Turbo V™ y una sonda ESI.

  • Se monitoreó un total de 95 transiciones en polaridad positiva y 18 en polaridad negativa con una pausa de 3 ms.

  • Se utilizó el algoritmo Scheduled MRM™ con una ventana de detección MRM de 90 s y un tiempo de barrido de objetivos de 0,7 s en el software Analyst® 1.6.

  • Se dejaron 50 ms para la inversión de polaridad.

Experimento 2:

  • Un gradiente de 15 min de buffer acuoso de formiato de amonio y metanol, con un flujo de 0.4 ml/min.
  • Se fijó el volumen de inyección en 10 µL.
  • Se utilizó el sistema AB SCIEX QTRAP® 4500 conla fuente Turbo V™ y una sonda ESI.

  • Se monitoreó un total de 508 transiciones en polaridad positiva (2 transiciones por cada compuesto) con una pausa de 3 ms.

  • Se utilizó el algoritmo Scheduled MRM™ con una ventana de detección MRM de 30 s y un tiempo de barrido de objetivos de 0,2 s en el software Analyst® 1.6.

  • Para aumentar la confiabilidad de la identificación de compuestos se obtuvieron espectros EPI a una velocidad de barrido de 10000 Da/s para optimizarla calidad MS/MS.

  • Los espectros EPI (Enhanced Product Ion Scan) están estandarizados a tres energías de colisión difundida (CES), 15 V con un ±35 V, a fin de garantizar el ión precursor característico de cada compuesto, mejorando eficientemente el patrón de fragmentación.
  • Se buscaron los espectros MS/MS en la biblioteca iMethod™ Forensic Library 2.1.

Experimento 3:

  • Un gradiente de 6 min de buffer acuoso de formiato de amonio y metanol, con un flujo de 2.2 ml/min
  • Se fijó el volumen de inyección en 10 µL.
  • Se utilizó el sistema AB SCIEX QTRAP® 4500 conla fuente Turbo V™ y una sonda ESI.

  • Se monitoreó un total de 256 transiciones en polaridad positiva con una pausa de 3 ms.

  • Se utilizó el algoritmo Scheduled MRM™ con una ventana de detección MRM de 30 s y un tiempo de barrido de objetivos de 0,1 s en el software Analyst® 1.6.

  • Para aumentar la confiabilidad de la identificación de compuestos se obtuvieron espectros EPI a una velocidad de barrido de 10000 Da/s, para optimizarla calidad MS/MS.

  • Los espectros EPI (Enhanced Product Ion Scan) están estandarizados a tres energías de colisión difundida (CES), 15 V con un ±35 V, a fin de garantizar el ión precursor característico de cada compuesto, mejorando eficientemente el patrón de fragmentación
  • Se buscaron los espectros MS/MS en la biblioteca iMethod™ Forensic Library 2.1.

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Resultados

Combinando Algoritmo Scheduled MRM™ con un veloz intercambio de Polaridad.

El algoritmo Scheduled MRM™ utiliza información sobre el tiempo de retención de cada analito para que cada transición MRM sea monitoreada en un breve lapso de tiempo. Esto significa que las transiciones no se monitorean a lo largo de todala corrida LC; en cambio, en todo momento el número de es significativamente reducido, lo que resulta en aumentar los ciclos de lectura de cada analito. El software calcula automáticamente la demora de cada transición MRM (Dwell Time) máxima para los compuestos co-eluyentes manteniendo el tiempo de ciclo necesario para la mejor relación señal/ruido (S/N), exactitud y reproducibilidad, manteniendo (o aumentando) la cantidad de puntos en el pico. Como resultado, el Scheduled MRM™ permite monitorear muchas más transiciones MRM en una sola corrida sin comprometer la calidad de los datos.

La versión mejorada del algoritmo Scheduled MRM™ en el software Analyst® 1.6 también permite combinar transiciones MRM pre-programadas con un veloz intercambio de polaridad para extender todavía más el panel de compuestos con un mayor rango de propiedades. En la Figura 2 se muestra la detección de drogas de abuso en una muestra de orina monitoreando 113 transiciones MRM en polaridad positiva y negativa utilizando el algoritmo Scheduled MRM™ y una rápida inversión de polaridad.

Figura 2: Detección de drogas de abuso extraídas de orina por monitoreo de 113 transiciones MRM en polaridad positiva y negativa utilizando el algoritmo Schedule MRM™ y cambio rápido de polaridad

Performance cuantitativa

El método LC-MS/MS desarrollado utilizando el algoritmo Scheduled MRM™ y una rápida inversión de polaridad arrojó excelentes datos cuantitativos. Muestras de orina fortificadas con estándares para calibrar fueron inyectadas cubriendo varios rangos, dependiendo del compuesto. Enla Figura 3 y 4 se muestran ejemplos de curvas de calibración.

Figura 3: Ejemplo de líneas de calibración del  cuantificador de transiciones MRM en el modo positivo

Figura 4: Ejemplo de líneas de calibración del cuantificador de transiciones MRM en el modo negativo

Para todos los compuestos en el rango de calibración se logró una exactitud de entre 80% y 120%. Se encontró un coeficiente de variación (%CV) mucho menor al 10%.

Estos resultados son excelentes y resaltan las ventajas de combinar el algoritmo Scheduled MRM™ con una rápida inversión de polaridad para un monitoreo cuantitativo de múltiples compuestos.

Identificación definitiva con búsqueda en librerías

A pesar de la alta selectividad de la detección MRM, siempre existe el riesgo de encontrar falsos-positivos debido a señales de interferencia provenientes de la matriz. Normalmente se realiza un segundo monitoreo MRM por cada analito, se calcula la relación entre la transición MRM de cualificación y la de cuantificación para cada muestra desconocida y se lo compara con la misma relación MRM de estándares para la confirmación. Sin embargo, se ha reportado que basar la identificación exclusivamente en relaciones de abundancia de transiciones MRM, puede resultar en un número significativo de falso-positivos, especialmente si los analitos buscados tienen una baja eficiencia de fragmentación (muchos iones-producto de baja intensidad). Para una mayor exactitud, se puede realizar una identificación utilizando experimentos MS/MS de barrido completo y búsquedas en biblioteca para comparar las muestras desconocidas con un espectro estándar. El modo de adquisición de estos espectros MS/MS escaneados, son realizados por parte de QTRAP® 4500 de una forma exaltada en sensibilidad, y se nominan espectros EPI (Escaneo Mejorado de Ion Producto). Para aumentar la confiabilidad de la detección, se realiza una búsqueda en biblioteca de los datos MS/MS (EPI) de alta calidad. Ejemplos de búsqueda de espectros en librerías EPI y obtención de valores de pureza espectral, son mostrados en las figuras 5 y 6, para muestras a muy bajas concentraciones de analitos.

Figura 6: Muestra de orina fortificada (dilución del extracto de 4.4) en la que realizó un screening de drogas de abuso  y comparación de espectros EPI frente a biblioteca de espectros a fin de lograr su identificación definitiva. La pureza  espectral expresada en porcentual de acierto, resultante de comparar versus la librería de espectros, arroja un valor de  84%, incluso sobre bajas concentraciones de meperidina.

En el mismo cromatograma pueden obtenerse datos cuantitativos y cualitativos simultáneamente. En la Figura 7 se muestra un ejemplo de curvas de calibración creadas a partir del mismo cromatograma para los dos compuestos identificados por búsqueda en biblioteca en las Figuras 5 y 6. La gran velocidad de barrido del sistema QTRAP® 4500 permite realizar una identificación definitiva, superando las limitaciones de la tradicional relación de transiciones MRM, pero al mismo tiempo permite obtener datos MS/MS de alta calidad en modo EPI para utilizar en búsqueda en biblioteca. La figura 8 muestra que la calidad espectrométrica, en cuanto a precision y exactitud, de un cromatograma de iones extraídos para dos transiciones MRM, frente a la identificación definitiva que brinda la obtención de un espectro EPI y comparación con Biblioteca de espectros comerciales.

Figura 6: Muestra de orina fortificada (dilución del extracto de 4.4) en la que realizó un screening de drogas de abuso  y comparación de espectros EPI frente a biblioteca de espectros a fin de lograr su identificación definitiva. La pureza  espectral expresada en porcentual de acierto, resultante de comparar versus la librería de espectros, arroja un valor de  78%, incluso sobre bajas concentraciones de metadona

Esta característica es especialmente importante cuando se combina UHPLC con MS/MS mara monitorear y confirmar un mayor número de analitos. El método desarrollado se utilizó para detectar 256 compuestos en un cromatograma de menos de 6 minutos. En la Figura 9 se muestran ejemplos de los espectros EPI resultantes, en el que fueron generados espectros EPI de elevada calidad, y comparados frente a la biblioteca en muestras de orina fortificadas con un número importante de analitos y usando UHPLC, en los que se requiere un ancho de pico de menos de 5 segundos.

Figura 7: Ejemplo de curvas de calibración generadas a partir de la misma prueba en la cual se obtuvo información cualitativa para la identificación confiable a través de la búsqueda bibliográfica. Rango lineal de 1,25 hasta 1,250 ng/ml

Resumen

El nuevo sistema LC-MS/MS QTRAP® 4500 es una poderosa herramienta para la cuantificación e identificación ultra-veloz de múltiples analitos en muestras forenses. Su capacidad de barrido de alta velocidad permite reducir los tiempos de demora de cada transición MRM y las pausas, resultando el detector ideal para los métodos UHPLCs utilizados en los laboratorios más modernos. A su vez, permite reducir el tiempo de análisis y aumentar el rendimiento de las muestras, manteniendo la calidad de los datos (sensibilidad, reproducibilidad, rango dinámico lineal, nula interferencia). Combinando el algoritmo Scheduled MRM™ con una rápida inversión de polaridad y la obtención de espectros MS/MS para la identificación de compuestos, este método LC-MS/MS permite realizar un análisis abarcativo del siempre creciente número de compuestos. Se utilizó con éxito en la cuantificación e identificación de drogas de abuso en muestras forenses, cubriendo un amplio rango de propiedades químicas, incluida la obtención de espectros de polaridad positiva y negativa a partir de una sola inyección.

Figura 8: Muestra de orina fortificada (dilución del extracto de 4.4) e inyectada, para luego ser analizada en modo MRM con 508 transiciones, con 2 de estas por compuesto, utilizando el algoritmo Scheduled MRMTM y por cada analito encontrado, se obtiene automáticamente un espectro EPI. Los datos cuantitativos y cualitativos son obtenidos de la misma inyección.

Figura 9. Identificación Definitiva utilizando espectros EPI y su comparación con librerías de espectros, obtenidas a escala UHPLC. A) Screening de los diferentes analitos en modo MRM (transiciones usadas luego para cuantificar), utilizando el algoritmo Scheduled MRMTM y por cada analito encontrado, se obtiene automáticamente un espectro EPI, con un cromatograma  de 6 minutos, monitorizando 256 compuestos, a 2.2 ml/min de flujo de fase móvil y anchos de picos de sólo 5 segundos. B) Ejemplo de obtención de un espectro EPI, adquirido a 10.000 Da/s de velocidad de barrido. C) Ejemplo de espectro EPI encontrado y comparado frente espectro de librería para confirmar definitivamente su identificación.

Referencias

1 A. Schreiber and Nadia Pace.: ApplicationNoteAB SCIEX (2010) 1282310-01.

2 K. von Czapiewski et al .: Application Note AB SCIEX (2011) 2110211-01.

3 A. Schreiber et al .: Application Note AB SCIEX (2010) 1121010-01.

4 M. J. M. Bueno et al .: Anal. Chem. 79 (2007) 9372-9384.

5 A. Schürmann et al .: Rapid Commun. Mass Spectrom. 23 (2009) 1196-1200.

6 M. Gros et al .: Anal. Chem. 81 (2009) 898-912.

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