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Nota 

Amplificando la certeza de confirmación en monitoreo y cuantificación de pesticidas presentes en muestras de frutas y vegetales utilizando sistemas LC/MS/MS QTRAP®

En comparación con los sistemas de triple cuadrupolo, los sistemas LC/MS/MS QTRAP® ofrecen: Selectividad y sensibilidad MRM (multiple reaction monitoring) de cuantificación con los límites de detección más bajos, excelente reproducibilidad e intervalo lineal, Funciones de escaneo rápido de trampa de iones lineal y de alta sensibilidad para análisis cuantitativo y confirmación, Espectros MS/MS ricos en información [...]

Amplificando la certeza de confirmación en monitoreo y cuantificación de pesticidas presentes en muestras de frutas y vegetales utilizando sistemas LC/MS/MS QTRAP®

En comparación con los sistemas de triple cuadrupolo, los sistemas LC/MS/MS QTRAP® ofrecen:

  • Selectividad y sensibilidad MRM ( multiple reaction monitoring ) de cuantificación con los límites de detección más bajos, excelente reproducibilidad e intervalo lineal
  • Funciones de escaneo rápido de trampa de iones lineal y de alta sensibilidad para análisis cuantitativo y confirmación
  • Espectros MS/MS ricos en información molecular, debido a la generación de iones fragmentarios en la celda de colisión LINAC® y al uso de una distribución de energías de colisión
  • Combinación de funciones de triple cuadrupolo y del sistema QTRAP® sin tiempo de demora en experimentos IDA, permitiendo la cuantificación y la confirmación con espectros MS/MS en una sola corrida LC
  • Mayor grado de confirmación basado en una búsqueda en una biblioteca de espectros, minimizando el riesgo de falsos positivos y negativos

La cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría de masas (MS/MS) es una poderosa herramienta analítica utilizada en tests de alimentos, ambientales y forenses, entre otros, para detectar múltiples analitos tales como pesticidas, sustancias ilícitas, esteroides, fármacos, y muchos otros contaminantes a niveles traza.

Una fuente de ionización única, que incluye los métodos de ionización por electrospray (ESI), de ionización química a presión atmosférica (APCI), y de fotoionización a presión atmosférica (APPI), facilita la ionización de compuestos polares a no polares. A continuación, los iones generados son transferidos hacia el analizador de masas a través de una interfaz de vacío.

Los analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) que operan en monitoreo de reacciones múltiples (MRM) se utilizan mayormente para la cuantificación de analitos. En el modo MRM, el primer cuadrupolo filtra un ión precursor específico; luego el segundo, la celda de colisión, genera fragmentos (iones producto); finalmente, éstos se filtran en el tercer cuadrupolo (Figura 2).

ABSciex es la única compañía que cuenta con la nueva generación de sistemas LC/MS/MS: espectrómetros de masas híbridos con triple cuadrupolo y trampa lineal de iones con introducción axial de iones (sistema QTRAP®). Este sistema ofrece posibilidades únicas ya que combina experimentos de triple cuadrupolo, como MRM, escaneo de iones precursores y de pérdidas neutras, con las funciones de escaneo de trampa de iones de alta sensibilidad, como MS mejorda, escaneo mejorado de iones producto, resolución mejorada y escaneo mejorado de iones multicargados y MS/MS/MS.2-4

Gracias a esta variedad de nuevos tipos de escaneo y a la posibilidad de combinarlos en una sola corrida LC, el sistema QTRAP® ofrece un esquema de trabajo completamente novedoso para múltiples aplicaciones LC/MS/MS, que incluyen tests alimenticios, ambientales y forenses, identificación de metabolitos y proteómica.5-15

Figura 1. Esquema de un sistema QTRAP® LC/MS/MS

Sinopsis

Este trabajo describe el uso de sistemas QTRAP® con cromatografía líquida en los procesos de monitoreo y confirmación de pesticidas en muestras de fruta y vegetales. Se comparan la selectividad, sensibilidad y exactitud de detección de un sistema QTRAP®, con las de un espectrómetro tradicional de triple cuadrupolo. Se destaca el mayor grado de confirmación de los escaneos MS/MS hechos con la trampa lineal de iones QTRAP®, seguidos por las búsquedas en biblioteca que minimizan el riesgo potencial de falsos positivos y negativos.

Introducción

La cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría de masas (MS/MS) es una poderosa herramienta analítica utilizada en tests de alimentos, ambientales y forenses, entre otros, para detectar múltiples analitos tales como pesticidas, sustancias ilícitas, esteroides, fármacos, y muchos otros contaminantes a niveles traza.

Una fuente de ionización única, que incluye los métodos de ionización por electrospray (ESI), de ionización química a presión atmosférica (APCI), y de fotoionización a presión atmosférica (APPI), facilita la ionización de compuestos polares a no polares. A continuación, los iones generados son transferidos hacia el analizador de masas a través de una interfaz de vacío.

Los analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) que operan en monitoreo de reacciones múltiples (MRM) se utilizan mayormente para la cuantificación de analitos. En el modo MRM, el primer cuadrupolo filtra un ión precursor específico; luego el segundo, la celda de colisión, genera fragmentos (iones producto); finalmente, éstos se filtran en el tercer cuadrupolo (Figura 2).

Figura 2. Screening y confirmación de pesticidas utilizando un sistema triple cuadrupolar y QTRAP® LC/MS/MS. Izquierda: detección de 150 monitoreos de reacciones múltiples para el screening de pesticidas. Central: Espectro de Ion Producto en un sistema triple cuadrupolar LC/MS/MS. Derecha: Espectro de Ion Producto mejorado utilizando un sistema QTRAP® MS/MS para confirmar la presencia de un pesticida detectado (Notar que la sensibilidad del sistema QTRAP® MS/MS es 100 veces mayor al espectro obtenido en el sistema triple cuadrupolar)

ABSciex es la única compañía que cuenta con la nueva generación de sistemas LC/MS/MS: espectrómetros de masas híbridos con triple cuadrupolo y trampa lineal de iones con introducción axial de iones (sistema QTRAP®). Este sistema ofrece posibilidades únicas ya que combina experimentos de triple cuadrupolo, como MRM, escaneo de iones precursores y de pérdidas neutras, con las funciones de escaneo de trampa de iones de alta sensibilidad, como MS mejorda, escaneo mejorado de iones producto, resolución mejorada y escaneo mejorado de iones multicargados y MS/MS/MS.2-4

Gracias a esta variedad de nuevos tipos de escaneo y a la posibilidad de combinarlos en una sola corrida LC, el sistema QTRAP® ofrece un esquema de trabajo completamente novedoso para múltiples aplicaciones LC/MS/MS, que incluyen tests alimenticios, ambientales y forenses, identificación de metabolitos y proteómica.5-15

Tecnología del sistema QTRAP®

La región del analizador de masas del sistema QTRAP® está basada en el camino del haz de iones de un espectrómetro triple cuadrupolo convencional. A diferencia de los sistemas QqQ, el tercer cuadrupolo (Q3) del sistema QTRAP® puede utilizarse como cuadrupolo o bien como trampa de iones lineal (LIT). La doble funcionalidad del Q3 permite al sistema QTRAP® hacer todo lo que puede un espectrómetro QqQ, incluso un verdadero monitoreo de reacciones múltiples para una cuantificación selectiva y sensible, y a la vez contar con funciones de escaneo LIT adicionales. Estas funciones mejoran enormemente el desempeño en aplicaciones de monitoreo, confirmación e identificación.

Figura 3: atrapamiento y escaneo de iones en una trampa de iones lineal.

La utilización del Q3 como LIT se divide en dos pasos: (1) colección o atrapamiento, y (2) escaneo, tal como se muestra en la Figura 3. Primero, los iones precursores y/o los iones producto, dependiendo del modo de escaneo seleccionado, salen de la celda de colisión para ingresar al Q3 operando en modo LIT. Los iones son atrapados en Q3 aplicando un radiofrecuencia (RF) en la dirección radial y un potencial de continua (DC) repulsivo en las lentes de salida del Q3. Después de un tiempo de unos pocos milisegundos para la acumulación de iones una “lente de entrada” repulsiva evita que los iones ingresen al Q3. Luego los iones atrapados se enfrían durante un breve intervalo, y seguidamente se los eyecta desde la LIT en forma axial mediante una rampa de voltaje auxiliar.

Los modos de escaneo LIT más importantes para aplicaciones de monitoreo, confirmación e identificación son: MS mejorado (EMS), Resolución mejorada (ER) y escaneo mejorado del iones productos (EPI).

En EMS, se acumulan en la trampa de iones los iones moleculares generados en la fuente de iones para identificar compuestos desconocidos. El escaneo ER mide la masa de un determinado ión con mayor exactitud, y puede utilizarse para determinar estados de carga y patrones isotópicos. Finalmente, el modo EPI se puede utilizar para confirmar la presencia del analito detectado mediante una interpretación de los iones fragmentarios o una búsqueda en la biblioteca de espectros de masa.

El escaneo EPI del sistema QTRAP® cuenta con importantes ventajas por sobre el escaneo de iones producto de los espectrómetros QqQ, que incluyen:

  • Una sensibilidad mucho mayor de los espectros EPI, debido a la acumulación de iones en la LIT (como se muestra en la Figura 2)
  • Más información sobre el ión producto en un solo espectro MS/MS, debido a la distribución de energía colosional utilizada.
  • Un tiempo de ciclo menor, debido al escaneo más rápido de la LIT

El escaneo EPI del sistema QTRAP® también posee importantes ventajas por sobre los espectrómetros de masas con trampa de iones tradicionales, que incluyen:

  • Una riqueza de fragmentos de los espectros MS/MS característicos de la disociación inducida por colisión (CID), en comparación con los espectros de excitación por resonancia
  • Sin el corte inherente de masas bajas, debido a que la generación de fragmentos se hace en la celda de colisión, y no en la trampa de iones
  • Un tiempo de ciclo menor al de las trampas de iones tradicionales, debido a que la selección y la fragmentación del ión precursor se hacen en simultáneo mientras el sistema QTRAP® se llena
  • Notable inmunidad del LIT a los efectos de carga del espacio que repercuten en un corrimiento en la relación m/q medida y en un patrón isotópico incorrecto en el espectro2-3

Experimental

Se utilizó un sistema LC/MS/MS 3200 QTRAP®, con una fuente Turbo V™ y una sonda ESI, tanto en modo triple cuadrupolo como en modo QTRAP®, para evaluar el desempeño de ambos espectrómetros de masas en el proceso de muestreo y confirmación de pesticidas.

Muestras

Las muestras de frutas y vegetales (banana, damasco, frutilla, kiwi, limón, manzana, naranja, pasas, pepino, pera, pimienta, pomelo, té, tomate y uvas) se obtuvieron utilizando una variante del método QuEChERS (“Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe”).16

HPLC

Se utilizó un sistema LC Shimadzu Prominence que constaba de un controlador del sistema CBM-20A, dos bombas LC-20AD, un degasificador DGU-20A3, un muestreador automático SIL-AC, y un horno de columna CTO-20AC. Se utilizó un gradiente de eluente A (agua con 5 mM de ácido fórmico) y eluente B (metanol con 5 mM de ácido fórmico) de 80/20 a 10/90 (A/B) por 8 minutos, en una columna RP 8 nm, 50 x 2 mm, con temperatura de columna en 25 °C. Se inyectó un volumen de muestra de 20 µL.

Detección MS/MS

En modo QqQ, se detectaron 75 pesticidas en polaridad positiva por medio de 2 transiciones MRM por analito.

La Tabla 1 presenta la lista de los iones cuantificadores y calificadores MRM con la respectiva relación de abundancia MRM. Los parámetros óptimos de detección para cada compuestos fueron optimizados para cada pesticida para obtener la máxima sensibilidad. El tiempo de lectura (dwell time) se fijó en 5 ms para toda transición MRM.

Este típico experimento de triple cuadrupolo se comparó con un único experimento QTRAP® IDA (del inglés, information dependent acquisition , es decir, que la adquisición de datos realizada está retroalimentada por la información obtenido) donde se monitoreó una sola transición MRM con un tiempo de lectura de 10 mseg por compuesto. Esta medición MRM automáticamente da comienzo a un escaneo EPI si la señal MRM supera el límite de 500 cps. Los espectros EPI se tomaron entre 50 y 550 AMU con una velocidad de escaneo de 4000 AMU/seg y una energía de colisión (CE) de 35 V con distribución de energía de colisión (CES) de 15 V. También se activó la exclusión dinámica minimizar el riesgo de error con los compuestos co-eluyentes.

Resultados

Selectividad MRM

La detección en MRM utilizando los sistemas QTRAP® y de triple cuadrupolo ofrece una mayor selectividad debido al doble filtrado de masa en el analizador. Esta selectividad resulta de gran ayuda para monitorear analitos conocidos y desconocidos en muestras complejas como extractos de frutas y vegetales. La Figura 4 muestra un ejemplo de detección MRM de 5,8 µg/kg de metazachlor en extracto de damasco. Debido a la gran selectividad de la detección MRM, ninguna señal de matriz interfiere con la cuantificación del contaminante identificado.

Figura 4: cuantificación y confirmación a través del cociente MRM de Metazachlor en un nivel de 5.8µg/kg en un extracto de damasco (278/134 y 278/210)

Sensibilidad MRM

Los sistemas QTRAP® y de triple cuadrupolo que se operan en MRM permiten realizar cuantificaciones a niveles traza con una sensibilidad superior. En la Tabla 1 se resumen los límites de detección (LoD) de 75 pesticidas.

La Figura 5 muestra ejemplos de cromatogramas de pesticidas presentes en un extracto de tomate a una concentración de 10 ng/mL. Todas las transiciones MRM en el método de monitoreo presentado se detectaron con un breve tiempo de lectura de 5 ms. La celda de colisión de aceleración lineal (LINAC®) permite reducir este tiempo de lectura sin que signifique una pérdida de sensibilidad.

Figura 5: ejemplo de cromatogramas de análisis de extracto de tomates fortificado con pesticidas en un nivel de 10ng/mL (izquierda) y el correspondiente espectro mejorado de Ion Producto a la misma concentración (derecha)

Confirmación mediante MRM ratios

Aun cuando se cuenta con un gran selectividad en la detección MRM, siempre existe un riesgo potencial de falsos positivos o negativos debido a la interferencia de señales de matriz. Por consiguiente, los resultados del monitoreo deben ser confirmados. Normalmente se monitorea un segundo MRM por analito y se calcula en cada muestra el cociente entre el cuantificador y el calificador y se los copra con dicho cociente obtenidos en soluciones estándares. Existen varias guías y regulaciones, como ser la Decisión 2002/657/EC de la Comunidad Europea, que definen la tolerancia en los coeficientes MRM para asegurar la confirmación (Tabla 2)17. La Figura 4 muestra un ejemplo de confirmación positiva basada en un cociente MRM de Metazachlor a un nivel 5,8 µg/kg en extracto de damasco.

Confirmación mediante espectros MS/MS y búsqueda en biblioteca del QTRAP®

Como alternativa, la confirmación puede realizarse mediante un experimento de escaneo completo MS/MS y una búsqueda en biblioteca para comparar un espectro desconocido o sospechoso con uno estándar. Como se muestra en la Figura 2, una confirmación basada en espectros MS/MS es más eficiente utilizando sistemas QTRAP®, gracias a su mayor sensibilidad y velocidad de escaneo, comparadas con un QqQ. Además, los sistemas QTRAP® cuentan con un mayor número de espectros MS/MS característicos y requieren un tiempo de ciclo menor que el de las trampas de iones tradicionales.

Figura 6: Cuantificación de Thiabendazole y Imazalil a un nivel de 135µg/kg y 15.2µg/kg, respectivamente, en extracto de banana. Confirmación positiva de Thiabendazole (0.55 con un rango de intervalo de tolerancia de 0.50-0.76) y confirmación negativa de Imazalil (0.50 con un rango de tolerancia de 0.28-0.46). Este falso negativo es evitado al utilizar un escaneo mejorado del espectro de Ion Producto (EPI) y búsqueda en bibliotecas.

La Figura 5 muestra los espectros EPI de pesticidas presentes en un extracto de tomate a una concentración de 10 ng/mL. Se obtuvieron en forma automática mediante IDA con un escaneo de investigación que contenía 75 transiciones MRM. Los resultados muestran que los espectros EPI son altamente selectivos y contienen la huella digital molecular completa del analito para confirmación. También poseen una sensibilidad superior y pueden buscarse en bibliotecas de masa espectral existentes. Este mayor grado de confirmación puede utilizarse para minimizar el riesgo potencial de detección de falsos positivos y negativos en base a un cálculo de los cocientes MRM. En la Figura 6 se presenta un ejemplo. En un extracto de banana se identificaron y cuantificaron por en cima del MRL los pesticidas tiabendazol e imazalil. Sin embargo, sólo al tiabendazol se lo confirmó por su cociente MRM. Al imazalil no se lo pudo confirmar por su cociente MRM de 0,50, siendo la tolerancia de 0,28-0,46. En comparación, el espectro EPI, rico en iones fragmentarios y su búsqueda en una biblioteca confirma claramente la presencia de ambos contaminantes en la muestra de banana, evitando la detección de falso negativo de imazalil.

Figura 7: Cuantificación de Metalaxyl a un nivel de 13.3µg/kg en extracto de frutilla. Identificación positiva confirmada a través del cociente MRM (0.72 con un rango de tolerancia de 0.59-0.89), pero la utilización del sistema QTRAP® MS/MS indica claramente que es un falso positivo.

La Figura 7 muestra otro ejemplo de la ventaja de una confirmación mediante búsqueda en biblioteca. El cociente MRM confirma la presencia de metalaxyl en un extracto de frutilla. El espectro EPI correspondiente y el resultado de la búsqueda en biblioteca identifican sin duda un falso positivo: por lo tanto no había metalaxyl en la muestra de frutilla.

Reproducibilidad de la cuantificación y de la confirmación

Un análisis confirmatorio mediante un escaneo EPI iniciado automáticamente, en lugar de un cálculo del cociente MRM, permite reducir el número de transiciones MRM monitoreadas. Para detectar y confirmar la presencia de 75 pesticidas, utilizando el método del QTRAP® sólo se deben monitorear 75 transiciones MRM, y no 150. La reducción en las transiciones MRM redujo el tiempo de ciclo del experimento MRM (QTRAP®: 1,1 seg. QqQ: 1,5 seg.), aunque se utiliza un mayor tiempo de lectura por cada transición. Esta reducción del tiempo de ciclo mejoró la reproducibilidad, ya que se obtuvo un mayor número datos muestreados a lo largo de los picos LC.

Se fortificó un extracto de tomate con una mezcla de pesticidas, y se analizó 10 veces utilizando los métodos QqQ y QTRAP®. Los datos presentados en la Tabla 3 y los ejemplos de espectros en la Figura 8 muestran sin lugar a dudas que la reproducibilidad de la confirmación basada en búsquedas en biblioteca de los espectros EPI es mayor que la que se obtiene mediante el cálculo del cociente MRM.

Figura 8: análisis repetitivo de un extracto de banana con la detección de Imazalil a un nivel de 15.2µg/kg. Los resultados de la búqueda en biblioteca del espectro mejorado de Ion Producto de muestra la alta reproducibilidad de confirmación del sistema QTRAP® MS/MS.

Resumen

Para el monitoreo y cuantificación de analitos se suele aplicar el método de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) usando sistemas LC/MS/MS de triple cuadrupolo. Sin embargo el QTRAP® ofrece una selectividad y sensibilidad incomparable. El doble filtrado de la masa en el analizador alcanza un grado máximo de relación señal/ruido (S/N) y por tanto un grado mínimo de límite de detección (LOD), con excelente reproducibilidad e intervalo lineal.

En aplicaciones tales como tests alimenticios, ambientales y forenses, entre otros, para la confirmación de los analitos detectados las normativas vigentes exigen información adicional del espectrómetro de masas. Esta confirmación habitualmente se realiza detectando dos transiciones MRM por cada compuesto y calculando el cociente MRM.

No obstante, con una creciente demanda de determinación para más contaminantes y en una mayor variedad de muestras, el número de transiciones MRM excede las posibilidades incluso de espectrómetros de masas actuales basado en triple cuadrupolo. Esto repercute en una limitación del número de compuestos que pueden monitorearse en cada inyección y/o en una menor reproducibilidad y exactitud debido a un número insuficiente de puntos muestreados a lo largo de los picos LC.

Es aquí donde los nuevos sistemas QTRAP®, con trampa de iones lineal híbrida con triple cuadrupolo, ofrecen un esquema de trabajo novedoso para el monitoreo y la confirmación de una multitud de analitos, combinando la selectividad de la detección MRM con la sensibilidad del escaneo MS/MS al utilizar el Q3 como LIT. En experimentos IDA, la detección de una señal MRM por encima de un límite especificado automáticamente da comienzo a un escaneo mejorado del ion producto (EPI). Estos espectros EPI son tan sensibles y selectivos como las señales MRM, y contienen la huella digital molecular completa (selección del ión precursor en el Q1, generación del ión producto en la celda de colisión, y acumulación del ión en la LIT). Los ricos espectros de masas obtenidos para el ion precursor son el resultado de la generación de iones fragmentarios en la celda de colisión. Estos espectros pueden buscarse en bibliotecas de masa espectral existentes.

La información guardada en un escaneo completo del espectro MS/MS permite llevar a cabo una confirmación con un grado mucho mayor de confianza, minimizando el riesgo de falsos positivos y negativos. Además, a partir de la mejora en el tiempo de ciclo de todas las transiciones MRM confirmatorias, se puede incrementar el tiempo de lectura de todas las demás transiciones MRM para mejorar la relación S/N, en beneficio de la reproducibilidad y la exactitud. O bien pueden monitorearse compuestos adicionales en el escaneo exploratorio MRM.

Referencias

  1. Technical Note “Advantages of Using Triple Quadrupole over Single Quadrupole Mass Spectrometry to Quantify and Confirm the Presence of Pesticides in Water and Soil Samples” #114AP55-01
  2. J. W. Hager: Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (2002) 512-526
  3. J. W. Hager and J. C. Y. Le Blanc: Rapid Commun. Mass Spectrom. 17 (2003) 1056-1064
  4. B. A. Collings et al.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14 (2003) 622-634
  5. P. Marquet et al.: J. Chromatogr. B 789 (2003) 9-18
  6. C . A. Mueller et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 19 (2005) 1332- 1338
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  11. Hongying Gao et al.: Rapid Commun. Mass Sprectrom. 21 (2007) 3683-3693
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  14. L . Anderson et al.: Molecular and Cellular Proteomics 5/4 (2006) 573-588
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  16. M . Anastassiades et al.: J. AOAC Int. 86 (2003) 412-431
  17. European Commission Decision 2002/657/EC

Adaptación

Gerencia de Capacitación y aplicaciones a partir de trabajo original de ABSciex, Concord, Ontario, Canada

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