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Nota 

Análisis cuantitativo de alta sensibilidad de impurezas e ingredientes activos a nivel traza mediante HPLC

A medida que avanza la tendencia hacia concentraciones menores de analitos, los métodos convencionales son cada vez menos capaces de llevar a cabo análisis a nivel traza. Por ejemplo, no sólo las impurezas afectan la calidad del producto, sino que son más las instancias en las que su seguridad puede verse comprometida. Esto ha motivado un control de impurezas más riguroso en las áreas donde es importante un análisis cuantitativo de niveles de impureza extremadamente bajos. Por otra parte, cuando el analito es el mismo ingrediente activo, resulta todavía más difícil establecer un método cuantitativo para concentraciones mínimas

1. Análisis cuantitativo de alta sensibilidad de sustancias a nivel traza

A medida que avanza la tendencia hacia concentraciones menores de analitos, los métodos convencionales son cada vez menos capaces de llevar a cabo análisis a nivel traza. Por ejemplo, no sólo las impurezas afectan la calidad del producto, sino que son más las instancias en las que su seguridad puede verse comprometida. Esto ha motivado un control de impurezas más riguroso en las áreas donde es importante un análisis cuantitativo de niveles de impureza extremadamente bajos. Por otra parte, cuando el analito es el mismo ingrediente activo, resulta todavía más difícil establecer un método cuantitativo para concentraciones mínimas.

Si bien el típico abordaje de esta situación consistiría en aumentar la sensibilidad incrementando la concentración de la muestra, de este modo la solubilidad del ingrediente principal podría verse seriamente afectada, o el analito podría no separarse lo suficiente de las sustancias obstructivas en la matriz de la muestra (Fig. 1). Para evitar este problema se necesitarían complicados procedimientos de pretratamiento que a su vez condicionarían la eficiencia debido al tiempo y esfuerzo requeridos.

Fig. 1: Ejemplo de pico de una impureza Fig. 1: Ejemplo de pico de una impureza

En consecuencia, para la cuantificación de analitos a nivel traza se deben satisfacer dos requisitos diferentes: aumentar la sensibilidad de las mediciones y acelerar las operaciones. La clave para ello está en automatizar todo el proceso, desde la recolección de fracciones (fraccionamiento) y la concentración de los analitos, hasta la cuantificación final (Fig. 2).

Fig. 2: Análisis cuantitativo automatizado de impurezas a nivel micro Fig. 2: Análisis cuantitativo automatizado de impurezas a nivel micro

2. Automatizando la cuantificación de sustancias a nivel traza

Si las funcionalidades de un HPLC convencional o de un UHPLC pudieran aplicarse para automatizar los tres pasos indicados en la Fig. 2 (fraccionamiento, concentración y cuantificación), se reducirían significativamente los costos y el tiempo destinados a la operación y al mantenimiento. Precisamente esto es lo que se logra con el extraordinario sistema Co-Sense para el análisis de impurezas (Nota 1), que puede construirse fácilmente utilizando la flexibilidad propia de un HPLC o UHPLC.

3. Sistema Co-Sense para el análisis de impurezas

Combinando la tecnología de conmutación de columnas y la de separación bidimensional, el sistema Co-Sense para el análisis de impurezas automatiza los procesos de los tres pasos operativos, que incluyen fraccionamiento, concentración y cuantificación. Este sistema no sólo puede construirse a partir del hardware Prominence, sino también combinando los módulos del UFLC(XR) y del Nexera. En ambos casos se logra una cuantificación de sustancias a nivel traza con alta sensibilidad y operación automática. A continuación se presentan los principios del sistema y algunas de sus aplicaciones.

Línea de flujo global del sistema

En la Fig. 3 se muestra el diagrama de la línea de flujo del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas, que consiste en las siguientes tres líneas:

(1) Línea de flujo de fraccionamiento (en rojo)

(2) Línea de flujo de concentración (en azul)

(3) Línea de flujo de cuantificación (en verde)

Fig. 3: Diagrama de líneas de flujo para el sistema Co-Sense para el análisis de impurezas Fig. 3: Diagrama de líneas de flujo para el sistema Co-Sense para el análisis de impurezas

Paso 1: Fraccionamiento

El muestreador automático inyecta la muestra y la separación comienza en la columna I. La válvula A de la línea de flujo en rojo se mantiene en la posición que se muestra en la Fig. 3, hasta que el componente buscado quede eluido por completo de la columna, de manera que todos los picos que no sean de esa sustancia sean desechados junto con la fase móvil.

Una vez que el componente buscado se ha eluido de la columna y ha pasado a través del detector A, la válvula A de la línea de flujo en rojo es conmutada. Esto le permite a la sustancia buscada pasar a fraccionamiento (en amarillo). El tiempo de conmutación de la válvula A se calcula a partir de los resultados obtenidos en ensayos anteriores.

Fig. 4: Paso 1 (fraccionamiento) Fig. 4: Paso 1 (fraccionamiento)

Paso 2: Concentración

Luego del fraccionamiento, la sustancia buscada (y tal vez algunos de sus picos vecinos) es dirigida por la válvula B hacia la columna II. (Fig. 5). Antes de alcanzar dicha columna (en el punto indicado como “T”), en la línea de flujo se introduce un gran volumen de nueva fase móvil desde la bomba II. Esta nueva fase móvil se selecciona específicamente para mejorar la retención de la sustancia buscada en la columna II. Por ejemplo, en el caso de un análisis por fase reversa, un solvente con alto porcentaje de agua sería eficaz para la concentración y entrampamiento de la sustancia en la columna II.

Fig. 5: Paso 2 (concentración) Fig. 5: Paso 2 (concentración)

Paso 3: Cuantificación

Completado el entrampamiento de la sustancia buscada, la entrega de solvente desde la bomba II se detiene, e inmediatamente se redirige por conmutación de la válvula B según se muestra en la Fig. 6 (en verde). Como la entrega de solvente a través de la columna II se alterna de las bombas I y II a las bombas III, la sustancia buscada (y tal vez algunos de sus picos vecinos) es eluida de la columna II y dirigida a la columna III.

Finalmente, tras una nueva y mayor separación al pasar por la columna III, la sustancia es detectada por el detector B.

Como se ve, los dos procesos de separación (fraccionamiento y cuantificación) y el de concentración que se llevan a cabo con este sistema permiten obtener una excelente separación con una sensibilidad mejorada, incluso si se utiliza un volumen mayor de inyección de la muestra.

Fig. 6: Paso 3 (cuantificación) Fig. 6: Paso 3 (cuantificación)

4. Ejemplo de aplicación del sistema Co-Sense

En las Fig. 7 y 8 se presentan ejemplos de aplicación del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas a nivel traza. La Fig. 7 muestra un análisis de cefazolina (0,5 mg/mL) fortificada con cafeína (equivalente a 0,0008 % de impureza). Aquí se utilizó una columna analítica de alta velocidad en el tercer paso para acelerar el análisis. Por otra parte, la Fig. 8 muestra un análisis de ritodrina (10 mg/mL) fortificada con metilparabeno (equivalente a 0.00001 % de impureza).

En los dos análisis se logró una excelente separación utilizando una composición diferente de fase móvil en cada paso de separación (fraccionamiento y cuantificación), además de columnas con distintas características de separación. Estas medidas permitieron realizar con éxito una cuantificación de sustancias a nivel traza, lo cual resulta problemático aplicando los métodos convencionales.

Fig. 7: Ejemplo de aplicación del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas (1) Fig. 7: Ejemplo de aplicación del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas (1)







































































































<<Step (1) – Fractionation Conditions>>
Column:Shim-pack VP-ODS (150 mmL. × 10.0 mmI.D., 5 ?m)
Mobile phase:A; 20 mmol/L phosphate buffer solution (pH 2.5)
B; Acetonitrile
Isocratic analysis B.CONC 15%
Flow rate:4.7 mL/min
Column temperature:40°C
Injection volume:1.5 mL
Wavelength:272 nm
Fraction interval:Target peak region (4.21 – 4.86 min)
<<Step (2) – Concentration Conditions>>
Column:Shim-pack GPRC-ODS (15 mmL. × 8.0 mmI.D., 5 ?m)
Additional mobile phase:100 mmol/L ammonium acetate aqueous solution
Flow rate:12.0 mL/min
Column temperature:40°C
<<Step (3) – Quantitation Conditions>>
Column:Synergi Hydro-RP (100 mmL. × 3.0 mmI.D., 2.5 ?m)(Note 2)
Mobile phase:A; 100 mmol/L ammonium acetate aqueous solution
B; Methanol
Gradient analysis
B.CONC 20% (0 min) 65% (5 min) 20% (5.01 – 10 min)
Flow rate:0.4 mL/min
Column temperature:40°C
Wavelength:272 nm

Fig. 8: Ejemplo de aplicación del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas (2) Fig. 8: Ejemplo de aplicación del sistema Co-Sense para el análisis de impurezas (2)































































































<<Step (1) – Fractionation Conditions>>
Column:Shim-pack VP-ODS (150 mmL. × 10.0 mmI.D., 5 ?m)
Mobile phase:A; 20 mmol/L phosphate (sodium) buffer solution (pH 2.5)
B; Methanol
Isocratic analysis B.CONC 35%
Flow rate:4.0 mL/min
Column temperature:40°C
Injection volume:200 ?L
Wavelength:254 nm
Fraction interval:Target peak region (12.0 – 13.2 min)
<<Step (2) – Concentration Conditions>>
ColumnShim-pack GPRC-ODS (15 mmL. × 8.0 mmI.D., 5 ?m)
Additional mobile phase50 mmol/L phosphate (ammonium) buffer solution (pH 6.8)
Flow rate8.0 mL/min
Column temperature40°C
<<Step (3) – Quantitation Conditions>>
Column:Shim-pack VP-ODS (150 mmL. × 4.6 mmI.D., 5 ?m)
Mobile phase:A; 20 mmol/L phosphate (sodium) buffer solution (pH 2.5)
B; Acetonitrile
Gradient analysis
B.CONC 10% (0 min) 55% (7 min)
Flow rate:1.0 mL/min
Column temperature:40°C
Wavelength:254 nm

Sistema LC/MS Nexera, LCMS-2020 Sistema LC/MS Nexera, LCMS-2020

5. Operación del sistema Co-Sense

Para hacer que la operación resulte lo más sencilla posible, el software para el sistema Co-Sense fue diseñado en base a una interfaz gráfica de usuario. Como se ve en la Fig. 10, no sólo se encuentran todos los parámetros necesarios consolidados en una sola ventana, sino que el estado de operación del sistema también se presenta gráficamente para un fácil monitoreo, permitiéndole a cualquier usuario llevar a cabo sin dificultad un análisis de sustancias a nivel traza.

Fig. 9: Sistema Co-Sense para el análisis de impurezas Fig. 9: Sistema Co-Sense para el análisis de impurezas

6. Uso de un espectrómetro de masas

Otra posibilidad de aplicación del sistema Co-Sense a la cuantificación de sustancias a nivel traza consiste en utilizarlo junto con un espectrómetro de masas. El uso de un UHPLC permite llevar a cabo análisis cuantitativos todavía más rápidos.

Puesto que los sistemas LCMS-8030 (LC/MS/MS de triple cuadrupolo) y LCMS-2020 (LC/MS de simple cuadrupolo) brindan un desempeño ultra elevado, con una inversión de polaridad en 15 mseg y una velocidad de barrido de 15.000 u/seg, al adoptar el Nexera como “ front-end ” se logra un nivel de espectrometría de masas ultra veloz que aprovecha al máximo las posibilidades del instrumento.

La decisión de utilizar el sistema Co-Sense con un HPLC (ó UHPLC) o bien con un LC/MS/MS (ó LC/MS) como base para la cuantificación de sustancias a nivel traza debe tomarse considerando diferentes factores tales como el costo inicial, el costo de mantenimiento, la frecuencia de los análisis y el nivel de sensibilidad buscado.

Fig. 10: Ventana de operación del sistema Co-Sense Fig. 10: Ventana de operación del sistema Co-Sense

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