Recientemente se han detectado casos de adulteración de productos alimenticios mediante compuestos ricos en nitrógeno, para hacer que el valor proteínico del alimento parezca más alto que su verdadero contenido. Para los productores y los organismos de control, esto ha incrementado la necesidad de utilizar técnicas analíticas rápidas y exactas que garanticen la confiabilidad de los productos.

En 2007, en EEUU, la presencia de melamina y ácido cianúrico en el gluten de trigo añadido a un alimento balanceado causó la insuficiencia renal y la muerte de cientos de perros y gatos. En 2008, en China, las autoridades detectaron la presencia de melamina en productos lácteos para bebés de varias empresas productoras; entre las miles de personas afectadas, se confirmaron seis muertes en el país, y los productos fueron retirados.1-4

Como respuesta a estos casos, se desarrolló un gran número de métodos analíticos para la detección de melamina y sus análogos, incluyendo algunos publicados por la FDA que también detectaban ácido cianúrico.4-8

Sin embargo, el método Kjeldahl, la técnica estándar para calcular el contenido proteínico indirectamente midiendo el contenido de nitrógeno, sigue siendo el más utilizado. Mientras el contenido proteínico no se determine en forma directa, la adulteración de alimentos con compuestos ricos en nitrógeno seguirá siendo una seria preocupación.

Para testear productos lácteos y proteína a granel se han desarrollado y validado métodos analíticos de detección de potenciales adulterantes (fuentes de nitrógeno no proteínico) que incluyen amidinurea, amelida, amelina, biuret, ácido cianúrico, ciromazina, dicianodiamida, melamina, triuret y urea (Figura 1).4,5

Recientemente se han encontrado trazas de dicianodiamida en leche producida en Nueva Zelanda. Los organismos de control se movieron rápidamente para asegurarse de que no hubiera riesgo para la salud. A continuación presentamos un método LC-MS/MS rápido, sencillo y sensitivo para detectar dicianodiamida y otros compuestos ricos en nitrógeno en leche y otros productos, con límites de cuantificación a nivel de µg/kg.

Figura 1. Potenciales adulterantes (fuentes de nitrógeno no proteínico) que incluyen melamina, ácido cianúrico, amelida, amelina, ciromazina, dicianodiamida, urea, biuret, triuret y amidinurea (de izq. a der. y de arriba abajo).

Experimental

Preparación de la muestra

Se realizó una extracción simple de muestras de alimentos utilizando el siguiente procedimiento:

• Se añadieron 10 mL de acetonitrilo con 2% de ácido fórmico a 1 g de una muestra homogeneizada.
• Se mezcló cuidadosamente y se trató la mezcla con ultrasonidos por 10 minutos.
• Se centrifugó por 10 minutos.
• Se transfirieron 50 µL del extracto a un vial del muestreador automático y se diluyeron en 950 µL de acetonitrilo, con un factor de dilución total de 200.

Si la muestra está muy contaminada, puede ser necesaria una mayor dilución.

LC

Los compuestos buscados fueron separados usando un gradiente en fase normal con una columna de cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC). La separación LC se logró utilizando un sistema Eksigent ekspert™ ultraLC 100, con una columna Phenomenex LUNA HILIC 3u (100 x 2 mm), y una fase móvil de acetonitrilo y agua con un contenido de 0,1% de ácido fórmico y 10 mM de formiato de amonio a un caudal de 0,2 mL/min (Tabla 1). El volumen de muestra inyectado fue de 10 µL.

MS/MS

Se utilizó un espectrómetro de masas AB SCIEX QTRAP® 5500, con una fuente de iones Turbo V™ y una sonda ESI. El instrumento operó en modo MRM, usando una rápida inversión de polaridad. Para la identificación de los compuestos, se monitorearon dos transiciones MRM selectivas por cada analito, usando la relación del ión cuantificador y cualificador (Tabla 2). Como estándar interno se utilizó 13C3 15N3-melamina.

Los datos resultantes se procesaron con el software MultiQuant™, versión 2.1.

Resultados y discusión

En primer lugar se evaluó el límite de detección y la reproducibilidad utilizando inyecciones de estándar de dicianodiamida y muestras de una matriz fortificada.

En la Figura 2 se muestra un cromatograma de dicianodiamida presente en leche a 2 µg/kg, con un coeficiente señal/ruido (S/N) de 54 para el ión cuantificador y de 13 para el cualificador.

Figura 2. Cromatograma LC-MS/MS de 2 µg/kg de dicianoamida presente en leche en una concentración de 0,01 ng/mL en el extracto final de una dilución de factor 200.

En la Figura 3 se muestran las líneas de calibración para dicianodiamida en leche, extraída mediante el procedimiento indicado con un factor de dilución total de 200. Para una cuantificación más exacta de los analitos buscados en la matriz de la muestra, se recomienda una dilución extensiva que minimice el posible efecto de la supresión del ión, ya que no puede compensarse usando un estándar interno.

En ambas transiciones se determine que el coeficiente de regresión fue superior a 0,997.

 

Figura 3. Líneas de calibración para dicianoamida presente en leche y analizada tras una dilución de factor 200.

Las relaciones MRM calculadas en todo el rango dinámico para la identificación de analitos se encontraron dentro del 25% de tolerancia esperado9 para una relación estándar de 0,392. Estas relaciones fueron calculadas e informadas en forma automática, utilizando la función ‘Multicomponent’ del software MultiQuant™.

En segunda instancia, el método se extendió para detectar otros posibles adulterantes. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de cromatograma.
Con polaridad positiva se detectó dicianodiamida (tiempo de retención TR = 2,0 min), melamina (TR = 4,6 min), amelina (TR = 4,7 min) y amelida (TR = 4,8 min); con polaridad negativa se detectó ácido cianúrico (TR = 2,1 min). Gracias al sistema de inversión rápida de polaridad, el QTRAP® 5500 pudo detectar dicianodiamida y ácido cianúrico en una sola corrida.

 

Figura 4. Cuantificación de cinco potenciales adulterantes (fuentes de nitrógeno no proteínico) en una sola corrida con inversión rápida de polaridad con el sistema AB SCIEX QTRAP® 5500.

En la Figura 5 se muestra un ejemplo de líneas de calibración para melamina (polaridad positiva) y ácido cianúrico (polaridad negativa). Todas las líneas de calibración tuvieron valores de r (coeficiente de correlación) mayores a 0,998.
Nótese que la matriz fortificada contenía trazas (< 10 µg/kg) de ácido cianúrico y que la línea de calibración no para por el cero. 

Figura 5. Líneas de calibración para melamina y ácido cianúrico presentes en leche y analizados tras una dilución de factor 200.

Las muestras de leche fueron analizadas utilizando el método desarrollado y los tests de dicianodiamida dieron resultado positivo. La función ‘Multicomponent’ se utilizó para calcular automáticamente la relación del ión cuantificador y cualificador usados para la identificación (Figura 6). 

Figura 6. Muestras de leche que arrojaron un resultado positivo en el testeo de dicianodiamida. La función ‘Multicomponent’ se utilizó para calcular automáticamente las relaciones MRM para la identificación de compuestos.

Resumen*

El método y los resultados presentados en este estudio muestran que, para un análisis de dicianodiamida y otros compuestos ricos en nitrógeno en muestras de leche y otros alimentos, la técnica LC-MS/MS es claramente una solución rápida, sencilla y exacta. El sistema AB SCIEX QTRAP® 5500 garantiza una excelente sensibilidad y selectividad en este tipo de análisis, exigiendo una mínima preparación de la muestra y permitiendo un máximo rendimiento en el análisis de múltiples muestras en muy poco tiempo.

En las muestras de leche, se logró cuantificar con éxito la dicianodiamida. Para la identificación de compuestos se utilizó la función de cálculo automático de relaciones MRM del software MultiQuant™.

Referencias

1. C.A. Brown et al.: ‘Outbreaks of Renal Failure Associated with Melamine and Cyanuric Acid in Dogs and Cats in 2004 and 2007’ J. Vet. Diagn. Invest. 19 (2007) 525-531
2. H. Xin and R. Stone: ‘Tainted Milk Scandal. Chinese Probe Unmasks High-Tech Adulteration with Melamine’ Science 322 (2008) 1310-1311
3. Y.C. Tyan et al.: ‘Melamine Contamination’ Bioanal. Chem. 395 (2009) 729-735
4. S. MacMahon et al.: ‘A Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Economically Motivated Adulteration in Protein-containing Foods’ J. Chromatogr. A 1220 (2012) 101-107
5. S. Turnipseed: ‘Determination of Melamine and Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS’ FDA LIB 4421 (2008) 1-18
6. M. Smoker and A.J. Krynitsky: ‘Melamine and Cyanuric Acid Residues in Foods’ FDA LIB 4422 (2008) 1-28
7. T. Sakuma et al.: ‘A New, Fast and Sensitive LC-MS/MS Method for the Accurate Quantitation and Identification of Melamine and Cyanuric Acid in Pet Food Samples’ Application Note AB SCIEX (2010) # 1283110-01
8. E. Braekevelt et al.: ‘Determination of Melamine, Ammeline, Ammelide and Cyanuric Acid in Infant Formula Purchased in Canada by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry’ Food Additives & Contaminants Part A Chem. Anal. Control Expo. Risk Assess. 28 (2011) 698-704
9. Document N° SANCO/12495/2011 ‘Method Validation and Quality Control Procedure for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed’ (2011)