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Aplicación 

Monitoreo de compuestos-objetivo (targeted) y no-objetivo (non-targeted) de residuos químicos en muestras de alimentos con el sistema TripleTOF™ 4600 e intuitivas herramientas de procesamiento

Los avances en la tecnología LC-MS/MS, incluyendo los sistemas híbridos como los Cuadrupolo/Cuadrupolo/Tiempo de Vuelo (TripleTOF™), ahora brindan la posibilidad de realizar monitoreos de compuestos-objetivo y de compuestos-no-objetivo como práctica de rutina. Así se obtiene información MS y MS/MS de alta resolución y gran exactitud en la forma de cromatogramas de barrido completo (full scan), lo que permite monitorear virtualmente toda sustancia química conocida e identificar y cuantificar contaminantes indeseados en forma rápida y sencilla

Abstract

Se utilizó el nuevo sistema AB SCIEX TripleTOF™ 4600 (QqTOF) para monitorear residuos químicos en extractos de frutas y vegetales. El espectrómetro de masas se operó usando una rápida Adquisición Información-Dependiente (IDA = Information Dependent Acquisition ), combinando un Screening en modo TOF-MS seguido por eventos confirmatorios TOF-MS/MS dependientes. Los datos TOF-MS se aplicaron para cuantificar con exactitud los compuestos-objetivo, y los espectros MS/MS sirvieron para identificar otros compuestos detectados con la mayor confiabilidad mediante una búsqueda en una biblioteca de espectros. La información MS y MS/MS obtenida fue extraída retrospectivamente para identificar compuestos-no-objetivo y desconocidos. Se utilizaron las novedosas herramientas del software PeakView® para controlar y comparar las muestras en forma automática durante el procesamiento de los datos.

Introducción

LC-MS/MS es una herramienta potente para el análisis de un amplio rango de compuestos polares, semi-volátiles y térmicamente lábiles. Los sistemas de triple cuadrupolo son muy utilizados para la cuantificación de cientos de compuestos-objetivo contaminantes de alimentos en un único análisis, fundamentalmente por su nivel de selectividad y sensibilidad al operar en modo MRM (Monitoreo de Reacciones Múltiples).

Los avances en la tecnología LC-MS/MS, incluyendo los sistemas híbridos como los Cuadrupolo/Cuadrupolo/Tiempo de Vuelo (TripleTOF™), ahora brindan la posibilidad de realizar monitoreos de compuestos-objetivo y de compuestos-no-objetivo como práctica de rutina. Así se obtiene información MS y MS/MS de alta resolución y gran exactitud en la forma de cromatogramas de barrido completo ( full scan ), lo que permite monitorear virtualmente toda sustancia química conocida e identificar y cuantificar contaminantes indeseados en forma rápida y sencilla.

Los cromatogramas de barrido completo son muy ricos en información y contienen miles de iones de cualquier compuesto de interés presente en la muestra, así como de la misma matriz de la muestra. En consecuencia, se necesitan potentes herramientas de software para explorar los datos de alta resolución y masa exacta generados.

Detalles del método

  • Muestras de frutas y vegetales, incluyendo productos “orgánicos” para una comparación entre muestra y muestra de control
  • Extracción QuEChERS seguida de una dilución 10x para minimizar posibles efectos de la matriz
  • Cuantificación usando el kit de estándares iD Quant ™ para análisis de residuos de plaguicidas
  • Sistema Ultra rápido Shimadzu UFLCXR con una columna Restek Ultra Aqueous C18 (100 x 2,1 mm) de 3 ?m y un gradiente de Agua/Metanol con 10 mM de formiato de amonio y un caudal 0,5 mL/min
  • Volumen de inyección de 10 ?L
  • Sistema AB SCIEX TripleTOF™ 4600 con fuente DuoSpray operada en modo de ionización por electrospray
  • Recalibración continúa y automática entre inyecciones mediante el sistema Calibrant Delivery System (CDS)
  • Adquisición información-dependiente (IDA) usando barrido exploratorio TOF 100-1000 Da (100 ms) y hasta 10 barridos dependientes TOF-MS/MS 50-1000 Da (100 ms) usando energía de colisión de 35 V con dispersión CES (Collision Energy Spread) de ±15 V
  • Procesamiento de datos cualitativo y cuantitativo usando el software PeakView® (versión 1.2) con XIC Manager y el software MultiQuant™ (versión 2.1)

Resultados y discusión

Monitoreo cualitativo e identificación

Los cromatogramas LC-MS/MS de alta resolución y masa exacta contienen información que comprende todas las moléculas presentes en la muestra que son susceptibles de ionización para la técnica y la polaridad utilizadas. Para monitorear compuestos-objetivo en forma selectiva se pueden generar cromatogramas de iones extraídos (XIC). Una resolución superior a 20.000 (ancho total a media altura) y una exactitud de masas por debajo de las 5 ppm suelen ser suficientes para separar los analitos de interés de la interferencia de las matrices, por lo que es un requisito para la identificación de compuestos en varias normativas internacionales.

El nuevo sistema AB SCIEX TripleTOF™ 4600 con analizador Accelerator TOF™ brinda una resolución máxima de 35.000 dependiendo de la masa detectada (Figura 1), y una exactitud de ~2 ppm con adquisición rápida en modo MS y MS/MS. Esto permite generar cromatogramas XIC estrechos para la mejor relación señal/ruido al monitorear un gran número de compuestos-objetivo, en este caso de residuos químicos en muestras complejas (Figura 2).

Figura 1. Resolución y exactitud de masas en todo el rango para los plaguicidas seleccionados en el kit de estándares iDQuant™.

Figura 1. Resolución y exactitud de masas en todo el rango para los plaguicidas seleccionados en el kit de estándares iDQuant™.

Figura 2. Mejora de la selectividad y de la relación señal/ruido utilizando cromatogramas de iones extraídos (XIC) estrechos.

Figura 2. Mejora de la selectividad y de la relación señal/ruido utilizando cromatogramas de iones extraídos (XIC) estrechos.

Se utilizó el software XIC Manager para monitorear e identificar residuos de plaguicidas en muestras de frutas y vegetales. Este programa por un lado facilita una tabla para definir la lista de masas o fórmulas para generar XIC, y por otro brinda la capacidad de revisar los resultados de la identificación de los compuestos detectados. La confiabilidad de los resultados se basa en el tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y la búsqueda en biblioteca MS/MS. Un sistema de “semáforos” indica la fiabilidad de la identificación de compuestos.

En las Figuras 3 y 4 se muestran ejemplos de identificación automática de plaguicidas en extractos de naranja clementina y col verde.

Figura 3. Identificación de imazalil y tiabendazol en una muestra de naranja clementina (el tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y la coincidencia en la biblioteca MS/MS se reportan automáticamente y se visualizan mediante “semáforos”). Figura 3. Identificación de imazalil y tiabendazol en una muestra de naranja clementina (el tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y la coincidencia en la biblioteca MS/MS se reportan automáticamente y se visualizan mediante “semáforos”).

Figura 4. Identificación de imidacloprid en una muestra de col verde (el tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y la coincidencia en la biblioteca MS/MS se reportan automáticamente y se visualizan mediante “semáforos”). Figura 4. Identificación de imidacloprid en una muestra de col verde (el tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y la coincidencia en la biblioteca MS/MS se reportan automáticamente y se visualizan mediante “semáforos”).

En la Figura 5 se muestra la identificación del fungicida dodemorf en una muestra de col basada en tiempos de retención, exactitud de masas y patrón isotópico. La poca coincidencia con lo hallado en la Biblioteca MS/MS (dictada por el bajo nivel de pureza) y la revisión MS/MS claramente indican la ausencia de dicha sustancia en el extracto de la muestra. Este ejemplo destaca la importancia de la información MS/MS para la identificación, ya que confiar solo en información MS de alta resolución puede resultar en falsos positivos.

Figura 5. La búsqueda en biblioteca MS/MS claramente prueba la ausencia de dodemorf en la muestra de col, más allá de la coincidencia de tiempo de retención, exactitud de masas y patrón isotópico. Figura 5. La búsqueda en biblioteca MS/MS claramente prueba la ausencia de dodemorf en la muestra de col, más allá de la coincidencia de tiempo de retención, exactitud de masas y patrón isotópico.

Análisis cuantitativo

El software XIC Manager también puede comparar las muestras cuantitativamente para resaltar los compuestos identificados que superen una determinada concentración. El software compara los datos de la muestra con una inyección estándar y automáticamente resalta todos los hallazgos por encima del límite definido por el usuario.

En la Figura 6 se muestra un ejemplo de identificación de los fungicidas imazalil y tiabendazol en una muestra de naranja en una concentración mayor a 5 ?g/kg.

Figura 6. Comparación cuantitativa de una muestra de naranja (extracto diluido 10X) y un estándar de plaguicida. El software XIC Manager identifica automáticamente imazalil y tiabendazol, y destaca que ambos plaguicidas tienen una señal de más del 50% que el estándar, que se corresponde con una concentración superior a 5 ?g/kg. Figura 6. Comparación cuantitativa de una muestra de naranja (extracto diluido 10X) y un estándar de plaguicida. El software XIC Manager identifica automáticamente imazalil y tiabendazol, y destaca que ambos plaguicidas tienen una señal de más del 50% que el estándar, que se corresponde con una concentración superior a 5 ?g/kg.

Además, los datos LC-MS/MS se pueden exportar al software MultiQuant™ para una cuantificación externa o interna utilizando inyecciones estándar en diferentes niveles de concentración. En la Figura 7 se muestra un ejemplo de línea de calibración para tiabendazol de 0,1 a 100 ng/mL. Los datos sobre la exactitud y la reproducibilidad se presentan en la Tabla 1; los plaguicidas hallados se presentan en la Tabla 2.

Figura 7. Cromatogramas a una concentración de 0,1 ng/mL y línea de calibración para tiabendazol (0,1 a 100 ng/mL) usando ajuste lineal con factor de peso 1/x. Figura 7. Cromatogramas a una concentración de 0,1 ng/mL y línea de calibración para tiabendazol (0,1 a 100 ng/mL) usando ajuste lineal con factor de peso 1/x.

Concentración (ng/mL) # de Inyecciones Exactitud (%) %CV
0.1 3 96.2 7.9
0.2 1 85 N/A
0.5 1 86.8 N/A
1 3 96.1 1.7
2 1 100.1 N/A
5 1 106.4 N/A
10 3 112.8 1.8
20 1 112.5 N/A
50 1 100.3 N/A
100 3 97.8 8

Tabla 1. Parámetros de Control de Calidad para Tiabendazol


Muestra Plaguicidas Error tR (%) Error de masa (mDa) PUR (%)
Naranja orgánica S/D - - -
Naranja Imazalil 0.3 0.2 91.6
Tiabendazol 0.1 0.5 97.9
Mandarina Imazalil 0.3 0.5 91.0
Tiabendazol 0.2 0.7 97.6
Jugo de naranja S/D - - -
Zanahoria S/D - - -
Pimiento Ciromazina 0.2 -0.1 71.5
Brócoli Imidacloprid 1.7 -0.3 82.9
Metalaxil 0.4 0.2 96.4
Espirotetramato 2.2 -0.5 96.3
Tiabendazol 1.1 -0.8 96.5
Colirrábano Imidacloprid 1.0 -0.5 85.4
Metoxifenocida 0.5 0.0 85.6
Col verde Imidacloprid 0.9 -0.6 75.3

Tabla 2. Plaguicidas encontrados en muestras de alimentos por encima de 5 mg/kg (S/D = sin detección)


Monitoreo de compuestos-no-objetivo e identificación de desconocidos

Otra característica del software XIC Manager es la capacidad de realizar comparaciones muestra-control para monitoreo de compuestos-no-objetivo o monitoreo general de desconocidos. En la Figura 8 se muestra como ejemplo una comparación entre una naranja “orgánica” y una “no-orgánica”. Todos los iones con una sensibilidad 20 veces mayor en la muestra que en el control son reportadas y automáticamente buscadas con la aplicación iMethod™ - Meta Library, que contiene espectros MS/MS de más de 2400 sustancias químicas, incluyendo plaguicidas, micotoxinas, drogas veterinarias y farmacéuticas, drogas de abuso, etc. Los dos fungicidas (imazalil y tiabendazol) fueron identificados con éxito, con una coincidencia mayor al 90% con lo hallado en la biblioteca.

Figura 8. Identificación de imazalil y tiabendazol por comparación muestra-control y búsqueda en biblioteca MS/MS. El software automáticamente reporta todos los iones que aparecen 20 veces más en la muestra que en el control.

Figura 8. Identificación de imazalil y tiabendazol por comparación muestra-control y búsqueda en biblioteca MS/MS. El software automáticamente reporta todos los iones que aparecen 20 veces más en la muestra que en el control.

El ejemplo presentado en la Figura 5 ilustra la importancia de la información MS/MS para la identificación confiable de compuestos. La búsqueda en biblioteca MS/MS se realizó para probar que no había presencia de dodemorf en el extracto de la muestra.

Como último paso se utilizó el nuevo buscador de fórmulas del software PeakView® (versión 1.2) para identificar en forma tentativa la fórmula y la estructura molecular del compuesto desconocido.

El buscador de fórmulas utiliza información de alta resolución sobre el ión molecular, aductos, patrón isotópico e ión fragmentario para calcular empíricamente potenciales fórmulas moleculares para el compuesto detectado. Existe una sola fórmula molecular que puede explicar el compuesto detectado al combinar todos los datos MS y MS/MS disponibles. Luego se buscó la fórmula calculada de C18H35NO en el ChemSpider, y se encontró un total de 6 posibles estructuras coincidentes (Figura 9).

Figura 9. Cálculo de formula empírica combinada con búsqueda ChemSpider en software PeakView®. La exactitud de masas, el patrón isotópico y los datos MS/MS se utilizaron para calcular la fórmula molecular y luego se buscaron automáticamente en las bases de datos online. Esto resultó en una fórmula molecular posible con un total de 6 potenciales estructuras.

Figura 9. Cálculo de formula empírica combinada con búsqueda ChemSpider en software PeakView®. La exactitud de masas, el patrón isotópico y los datos MS/MS se utilizaron para calcular la fórmula molecular y luego se buscaron automáticamente en las bases de datos online. Esto resultó en una fórmula molecular posible con un total de 6 potenciales estructuras.

Una de las coincidencias fue con la oleamida, (Z)-Octa-9-decenamida y una amida del ácido oleico. Esto era muy probable, ya que se trata de una sustancia endógena con isómeros E y Z que explican el doble pico en el cromatograma.

Las estructuras de la oleamida y del dodemorf se importaron a la herramienta de predicción de fragmentación del software PeakView®. Esta herramienta compara automáticamente el patrón experimental MS/MS con otro patrón de fragmentación teórico utilizando las estructuras propuestas. En este caso, el 100% de los iones fragmentarios observados se explicaban por la estructura de la oleamida, pero sólo un 71% de los 36 iones se explicaban por la del dodemorf, quedando excluidos los dos fragmentarios más característicos (Figuras 10 y 11). Esto sugiere una vez más que el dodemorf no estaba presente en la muestra de col, y el compuesto detectado fue identificado tentativamente como oleamida.

Figura 10. Predicción de iones fragmento MS/MS para oleamida. El 100% de los iones MS/MS se explican por la estructura de la oleamida.

Figura 10. Predicción de iones fragmento MS/MS para oleamida. El 100% de los iones MS/MS se explican por la estructura de la oleamida.

Figura 11. Predicción de iones fragmento MS/MS para dodemorf. Muchos iones MS/MS no se explican por la estructura del dodemorf, sugiriendo que esta sustancia no está presente en la muestra de col.

Figura 11. Predicción de iones fragmento MS/MS para dodemorf. Muchos iones MS/MS no se explican por la estructura del dodemorf, sugiriendo que esta sustancia no está presente en la muestra de col.

Resumen

Utilizando el nuevo sistema AB SCIEX TripleTOF™, se desarrolló y aplicó con éxito un procedimiento directo para monitorear e identificar residuos químicos en muestras de alimentos, utilizando una extracción genérica y LC-MS/MS de alta resolución y exactitud de masas. El nivel de sensibilidad y de resolución, y la velocidad de barrido sin igual del analizador Accelerator TOF™, permitieron realizar una cuantificación exacta y reproducible a niveles máximos regulados de residuos. Fue posible una dilución del extracto para minimizar posibles efectos de matriz.

Los datos se procesaron utilizando el software PeakView® con XIC Manager y el MultiQuant™ para identificar y cuantificar los compuestos-objetivo en las muestras de alimentos por medio del tiempo de retención, la exactitud de masas, el patrón isotópico y una búsqueda en biblioteca MS/MS. Dicha búsqueda resultó particularmente decisiva para minimizar los potenciales resultados falsos positivos.

También se utilizó el software PeakView® para llevar a cabo una comparación muestra-control, lo que permitió encontrar compuestos-no-objetivo inesperados y que luego fueron identificados por un cálculo empírico de la fórmula y una búsqueda automática en el ChemSpider.

Monitoreo de compuestos-objetivo (targeted)  y no-objetivo (non-targeted) de residuos químicos en muestras de alimentos con el sistema TripleTOF™ 4600 e intuitivas herramientas de procesamiento

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