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Nota 

Cuantificación y confirmación del pesticida malatión en muestras de fruta mediante MRM y MS-MS-MS

En el modo MRM, el primer cuadrupolo (Q1) filtra un ión precursor específico, la celda de colisión (Q2) genera fragmentos (iones producto), que luego se filtran en el tercer cuadrupolo (Q3). Aunque este doble filtrado reduce el nivel de ruido en buena medida, siempre existe la posibilidad de que un elevado ruido de fondo o las señales de la matriz interfieran con el analito buscado.

En el modo MRM, el primer cuadrupolo (Q1) filtra un ión precursor específico, la celda de colisión (Q2) genera fragmentos (iones producto), que luego se filtran en el tercer cuadrupolo (Q3). Aunque este doble filtrado reduce el nivel de ruido en buena medida, siempre existe la posibilidad de que un elevado ruido de fondo o las señales de la matriz interfieran con el analito buscado.

Una posibilidad de mejorar los resultados cuantitativos consiste en utilizar un modo de detección más selectivo, como MS/MS/MS (MS3). Cuando se opera un sistema QTRAP® en modo MS3, primero el Q1 filtra el primer ión precursor, luego el Q2 genera iones producto, y finalmente el Q3 los atrapa operando como trampa de iones lineal (LIT). A continuación, la LIT aísla el segundo ión precursor y da lugar a la segunda generación de iones producto, que son barridos fuera de la trampa hacia el detector. Comparado con el MRM, el modo MS3 ofrece una mayor selectividad, gracias a que cuenta con un paso adicional en la fragmentación. En la Figura 1 se ilustran ambos modos de operación.

El moderno sistema QTRAP® 5500 utiliza la nueva trampa Linear Accelerator™, diseñada para reducir el tiempo de fragmentación y aumentar la eficiencia de la excitación, ofreciendo un nuevo nivel de performance en MS3. Esto, junto con la gran sensibilidad del espectrómetro de masas y un velocidad de barrido más rápida (hasta 20.000 Da/s), permite utilizar MS3 con límites de detección más bajos y en un lapso de tiempo menor que con las versiones anteriores de los sistemas QTRAP®.

DETALLES DEL MÉTODO

  • Sistema de cromatografía líquida Shimadzu UFLC XR equipado con columna Phenomenex Synergi Fusion-RP (2.5µm), utilizando un gradiente rápido buffer formiato de amonio y metanol.

  • Espectrómetro de masas AB SCIEX QTRAP® 5500 equipado con fuente ESI Turbo V™.

  • Experimento 1: detección de dos transiciones MRM con un tiempo de lectura de 100 ms.

  • Experimento 2: detección de dos barridos de MS3 a 20.000 Da/s con un tiempo de llenado de 20 ms y un tiempo de excitación de 25 ms (lapso de tiempo total: 0,33 s).

La figura 2 muestra para cada compuesto las masas utilizadas en modo in MRM y MS3

RESULTADOS

Selectividad

Se fortificó una homogenato de manzana con 10 ppb de malatión, se realizó la extracción por medio del procedimiento QuEChERS, se diluyó 50 veces para minimizar los efectos de matriz, y se llevó a cabo el análisis mediante LC-MS/MS. En la Figura 3 se muestran los cromatogramas resultantes usando dos transiciones MRM y dos experimentos MS3. La transición MRM 331/127 mostró la selectividad esperada, pero la segunda transición 331/99 tuvo un alto nivel de ruido de fondo y una elevada interferencia de matriz. Por el contrario, ambos experimentos MS3 mostraron una selectividad superior para una cuantificación más confiable.

Sensibilidad

En la Tabla 1 se muestra la proporción señal/ruido (S/N) de los cromatogramas descriptos arriba. El cuantificador MRM y el cuantificador MS3 mostraron una sensibilidad muy similar. Ambos experimentos permitieron cuantificar malatión a niveles por debajo de la parte por billón.

Sin embargo, el testeo de pesticidas requiere información confirmatoria. Es por eso que se necesita registrar un segundo MRM o señal MS3 que permita calcular las proporciones (cualificador/cuantificador). En el ejemplo presentado, el segundo MRM mostró una fuerte pérdida en el valor S/N comparado con la señal MS3, debida al elevado ruido de fondo. En este caso, la cuantificación y confirmación de malatión en fruta resultó mucho más sensible en modo MS3 que en modo MRM.

En condiciones tradicionales el uso de MS3 sufre la necesidad de períodos de ciclos largos. Normalmente este tiempo largo resulta en una menor exactitud y reproducibilidad. El sistema QTRAP 5500 junto con la nueva trampa Linear AcceleratorTM puede realizar experimentos MS3 en forma mucho más rápida que cualquier otra trampa de iones. Por ejemplo, con el método utilizado para este estudio se realizaron dos barridos MS3 en un ciclo de sólo 0,33 segundos, lo que permite 15 puntos de adquisición a lo largo de un pico de UHPLC de tan solo 5 de ancho de base a base.

Se fortificaron muestras de fruta con 10 ppb de matatión y se analizaron en replicado. Mientras en la detección de MRM sufrió interferencia de la matriz, con MS3 se lograron datos más precisos y reproducibles. % DER (desviación estándar relativa) en damasco, manzana, pera y naranja fue menor al 5%, con una precisión entre 90% y 110%. Además, el cálculo de cociente MS3 confirmó claramente la presencia de malatión en las frutas analizadas.

RESUMEN

Usando el nuevo sistema LC-MS/MS QTRAP 5500, se desarrollaron métodos LC-MS/MS para cuantificar y confirmar la presencia del pesticida organofosforado malatión en nuestras de fruta. Se utilizaron escaneos MRM y MS/MS/MS. Se compararon ambos métodos en cuanto a la selectividad, sensibilidad, exactitud y reproducibilidad. Los resultados muestran que la mayor selectividad del MS3 elimina la interferencia del fondo y de la matriz, lo que resulta en datos de mayor calidad. El MS3 arrojó datos comparables a los de MRM en cuanto a la señal cuantificadora pero lo superó ampliamente en sensibilidad, exactitud y reproducibilidad para la señal calificadora en la matriz de fruta.

Figura 1: Principios del MRM y del MS-MS-MS en un sistema QTRAP® 5500 (AB SCIEX).

Figura 2: Detección de malatión por medio de los siguientes experimentos MS: MRM of 331/127 and 331/99 and MS/MS/MS of 331/127 quantifying the 2nd product ion 99 and 331/99 quantifying the 2nd product ion 71.

Figura 3: Comparación de selectividad al detectar malatión en un extracto de manzana (10 ppb). Mientras que la primera transición MRM 331/127 mostró la selectividad esperada, la segunda transición MRM 331/99 tuvo un alto nivel de ruido de fondo y una elevada interferencia de matriz. Por el contrario, ambos experimentos MS3 mostraron una selectividad superior.

MRM S/N MS-MS-MS S/N
331/127 922 331/127/99 497
331/99 8 (alto ruido de fondo) 331/99/71 147

Tabla 1: Proporción señal/ruido (S/N) en MRM y MS-MS-MS de malatión (10 ppb) en un extracto de manzana diluido 50 veces.

AUTORES

  • André Schreiber (Applied Biosystems, Concord, Ontario, Canadá)

  • Tania Sasaki (Applied Biosystems, Foster City, California, EEUU)

  • Tanya Gamble (MDS Analytical Technologies, Concord, Ontario, Canadá)

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